泌乳素及其受体在尖锐湿疣的表达

江中洪 江玉娥 曾茂森

尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)是人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染外生殖器、肛周等部位引起的一种常见的、易复发的性传播疾病。许多研究表明，CA的发生、消退、复发及癌变与机体的免疫功能密切相关。泌乳素(prolactin, PRL)是垂体前叶分泌的多肽激素，皮肤是垂体外PRL的重要合成及靶向器官，参与调节细胞增殖与分化、免疫应答等生理过程。本研究采用化学发光法和免疫组化检测CA患者外周血PRL以及皮损泌乳素受体(prolactin receptor, PRLR)的表达情况，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2017年6月至2018年6月在我院皮肤性病科和妇产科就诊的尖锐湿疣患者共40例，均符合《中国临床皮肤病学》中尖锐湿疣的诊断标准[1]。男、女各20例，年龄18～38岁，平均(24.3±4.2)岁，患者1年内均未接受免疫抑制剂治疗，排除口服大量雌激素、避孕药、妊娠及哺乳期妇女，且无严重心肝肾疾病、肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病及其他感染性疾病。对照组包皮组织和外周血PRL取自健康男性20名，平均(20.4±7.2)岁，由皮肤外科和泌尿外科提供，另再抽取非孕期健康女性20名外周血PRL作为对照组。所有皮肤和皮损标本经10%甲醛固定，石蜡包埋并连续切片。两组在年龄构成(t=0.49,P=0.72)差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经过医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂 Access2化学发光免疫分析仪购自美国Beckman coulter公司，PRL试剂购自罗氏公司，BX51-P双目电子显微镜购自日本Olympus株式会社，兔抗人PRLR抗体购自武汉博士德公司。

1.3 方法

1.3.1 PRL检测 所有入选对象均用干燥管收集外周血3ml，及时分离血清检测，由检验科按操作常规进行上机检测。

1.3.2 免疫组化SP法 采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP法)进行检测，接试剂盒说明书进行。手术取尖锐湿疣皮损和对照组包皮组织，4%甲醛液固定，石蜡包埋，连续4 μm切片。切片脱蜡至水，3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，抗原120℃修复3 min，正常山羊血清封闭10 min，加入一抗37℃孵育1 h，生物素标记的二抗和链霉亲和素-过氧化物酶(SP)复合物各在37℃温箱孵育30 min。DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。用已知阳性片作阳性对照。用PBS代替一抗作空白对照。

1.3.3 结果判定[2]免疫组化染色以胞质或胞膜棕黄色着色为阳性细胞，根据阳性细胞着色强度和百分比确定PRLR表达的半定量分级：①按细胞着色强度,无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；②按阳性细胞百分比，≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。据上述两项分值的乘积，0为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，6～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。采取单盲法，每张切片随机选取5个高倍(×400)视野，取其得分的平均数判断该标本的半定量等级，表达阳性率：表达阳性率=阳性标本数/总标本数×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析，计数资料的比较采用χ2检验，计量资料用均数±标准差表示，采用独立样本t检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血PRL在尖锐湿疣患者和对照组的表达比较 本院PRL参考值男性为(4.04～15.20)ng/mL，非孕期女性为(4.79～23.30)ng/mL，本次实验男性CA患者PRL为(9.24±4.68)ng/mL，健康男性对照组为(8.42±3.83)ng/mL，两组比较差异无统计学意义(t=0.606,P=0.548)，女性CA患者为(14.62±6.23)ng/mL，健康女性对照组为(12.42±5.46)ng/mL，两组比较差异无统计学意义(t=1.188,P=0.242)，见表1。

表1 各组PRL表达水平比较(ng/mL)

2.2 PRLR在尖锐湿疣皮损和正常包皮组织中的表达比较 见表2。

表2 PRLR在CA组和包皮组皮损表达情况(例)

PRLR在尖锐湿疣皮损有不同程度的阳性表达，PRLR受体阳性细胞集中分布于基底层、棘层细胞下部，中到强阳性表达，在角质层细胞较少表达。疣体血管内皮细胞也可见到中到强阳性表达(图1)。在20名健康者的包皮组织PRLR受体呈弱阳性表达或不表达，分布于基底层细胞和棘层细胞 (图2)。CA患者PRLR受体阳性表达水平均显著高于对照组(χ2=33.35，P=0.00)。

图1 a,b,c在基底层及基层下部细胞、血管内皮细胞的胞质及胞膜被染成棕黄色(SP，×200)

图2 a,b,c在基底层及基层下部细胞、血管内皮细胞的胞质及胞膜被染成浅棕黄色(SP，×200)

3 讨论

PRL由199个氨基酸组成的23kDa单链蛋白，由于翻译后加工、修饰的不同，23 kDa的 PRL经蛋白水解切割后可生成14kDa、17kDa及22 kDa的变异型，在血清中PRL多以单体形式存在，也可形成二聚体、三聚体。PRL主要的功能是在妊娠期和哺乳期促进乳腺发育，乳汁合成和乳汁分泌的维持[3]。PRLR是造血细胞因子受体超家族成员，包括细胞外结构域，单个跨膜结构域和细胞内信号转导结构域，几乎存在于所有的组织和器官。由于选择转录和翻译不同，PRLR主要包括2个亚型:长型分子量为87 kDa，对PRL 亲和力较高；短型分子量为36 kDa，对PRL亲和力较低。这些同种型具有相同的细胞外结构域，但细胞内部分的大小和序列可能不同；此外，还有一种可溶性PRLR(PRL结合蛋白)，只含有膜受体的细胞外结构域。在人体中发现的PRLR的主要同种型是长型，人PRLR除与PRL结合， PRLR还可以结合胎盘催乳素和生长激素[4]。

PRL与膜受体PRLR结合形成三聚体，通过激活JAK2/STAT5、c-Src、PI3K/AKT、MAPK、Nek3-vav2-Racl等信号通路发挥生物学作用。PRL及PRLR表达于角质形成细胞、皮肤附属器、血管内皮细胞、成纤维细胞及免疫细胞中，参与调节细胞增殖与分化、毛囊周期、免疫应答等生理过程[5]。与垂体不同的是皮肤细胞中PRL及其受体表达主要受P物质、IFN-γ及TNF-α等细胞因子的调节[1，3]。

在表皮中PRL及PRLR主要表达于基底细胞层，PRL可促进表皮KC增殖，在体外培养皮肤KC中，PRLR表达与KC分化程度有关[6]。在皮肤免疫系统中，真皮T细胞、B细胞、巨噬细胞等均可表达PRLR，PRL可促进T细胞、B细胞增殖，抑制糖皮质激素诱导的淋巴细胞凋亡[7]。PRL可促进B细胞的抗原反应性、免疫球蛋白和自身抗体产生，增加Th-1细胞分泌IFN-γ、IL-2，PRL可促进巨噬细胞分泌IL-2发挥抗肿瘤作用[8]。PRL还可通过增加IFN-α分泌，影响朗格汉斯细胞的迁移、抗原提呈功能，在免疫反应中扮演着重要的角色[9]。

血管内皮细胞中低表达PRL，PRL可以通过上皮细胞、白细胞、巨噬细胞刺激血管生成因子如血管内皮生长因子(VEGF)的表达。PRL及其变异型在血管内皮细胞增殖和血管形成中起重要作用，23 kDa PRL可刺激血管形成，而16 kDa PRL通过与血管内皮细胞结合，抑制其增殖和促进凋亡，被称为血管抑制素，还可抑制血管内皮细胞迁移，收缩血管降低血管通透性，而且对肿瘤的发生有抑制作用[10]。

有研究者对顽固性复发的合并有高泌乳素(HPL)血症的女性CA患者，通过口服溴隐亭降低血泌乳素水平后，CA的复发明显减少[11]。本实验结果显示，PRLR受体阳性细胞集中分布于基底层、棘层细胞下部，中到强阳性表达，在角质层细胞较少表达，提示PRL可刺激基底层细胞的增殖；同时，疣体血管内皮也可见PRLR的中到强阳性表达，提示PRL在血管的增殖和形成中起重要作用。但在患者外周血中检测PRL，较健康对照组稍高，但差异无统计学意义(P>0.05)，部分复发性CA患者PRL升高较为明显，与顽固性复发的合并有高泌乳素血症的女性CA患者不同的是，本研究中仅仅是部分复发性CA患者PRL升高较为明显，推测患者皮损PRLR表达的增强，可能与HPV促进角质形成细胞的异常分化有关，或者是PRLR表型的表达出现变异有关，与PRL的结合力发生增强，其中的机制值得进一步探讨。