高温微生物铁还原条件下绿脱石对有机质的保存作用研究*

曾强 董海良，2** 汪丹

1.中国地质大学地球科学与资源学院，北京 100083

2.中国地质大学生物地质与环境地质国家重点实验室，北京 100083

碳循环问题是当今备受科学界关注的热点问题。与无机碳库相比，有机碳库的循环速度更快，其高度动态化的性质对人类活动和气候变化等问题都具有着深远的影响（Sombroeketal.，1993）。而有机质的性质和赋存状态是影响碳循环速率的重要因素。地表环境中绝大多数有机碳都与多种多样的矿物结合在一起。不同的矿物类型影响着有机质与矿物结合的方式及其稳定性（Keil and Mayer，2013）。因此，研究多种的环境因素影响下这些矿物-有机质复合体的稳定性，对于揭示地表环境复杂的碳循环过程具有十分重要的启示意义。

粘土矿物是一种由硅氧四面体和金属（Al，Fe，Mg）氧八面体片构成基本单元的层状硅酸盐，这些细小矿物广泛分布于土壤、沉积物、沉积岩等地表环境，许多粘土矿物结构都含有不同程度的铁，可以说粘土矿物是铁的重要载体之一（Stuckietal.，2012）。粘土矿物由于具有巨大的比表面积、阳离子交换能力、以及部分种类具有可膨胀的层间域，使其在环境中能够结合大量的有机质。粘土矿物结构铁的氧化还原态变化（即 Fe（II）■Fe（III））对于粘土矿物的理化性质有着深刻的影响（Stucki，2011），而这一变化也可能进一步影响粘土矿物与有机质的结合状态。其中，粘土矿物结构Fe（III）的微生物还原过程被广泛地发现于各类环境之中（Dongetal.，2009）。许多功能微生物类群都能利用粘土矿物中的结构Fe（III）作为电子传递的受体。之前的研究发现，一些常温至中温的具有铁还原能力的细菌能够通过结构Fe（III）还原作用释放少部分插入粘土矿物层间域的有机质，而大部分的有机质能够在还原-氧化波动的环境中保存下来，说明某些粘土矿物的可膨胀层间域可以有效地保存有机质，能够抵御外界氧化还原条件波动对有机质矿化的影响（Zhangetal.，2014；Zengetal.，2016）。然而这一过程在中高温的条件下是否同样存在，目前尚未有任何报导。本研究的目的就在于探究两株中高温的异化铁还原菌对于插层态的粘土矿物-有机质复合体的还原作用以及该过程对有机质的释放效果。

1 材料与方法

1.1 绿脱石-有机质复合体的制备

实验选择一种产自澳大利亚Uley矿床的绿脱石作为含铁粘土矿物的代表（称为NAu-2），主要因为其具有较高的结构铁含量，其含铁量约为21.2%，其中98%的结构铁均为Fe（III）（Keeling，2000）。12-氨基十二酸（12-Aminododecanic Acid，ALA）作为一种模式有机物用于合成有机质-粘土复合体。选用ALA作为模式有机物主要基于两个原因：一是它含有羧基以及适当碳数目的烷基链，这是环境中与粘土矿物结合的有机物的重要特征（Wattel-Koekkoeketal.，2001）；二是ALA具有的丙氨基基团（-NH2），在酸性条件下可以通过质子化转化为氨基基团（-NH3+），从而通过阳离子交换作用插层进入NAu-2的层间域。

ALA插层实验前，首先将块状的NAu-2人工研磨过筛，然后配置成10g／L的悬浊液，充分搅拌24h使其均匀分散。而后，配置浓度约为该悬浊液的NAu-2两倍阳离子交换量（CEC）的ALA溶液。将ALA加入到粘土溶液前，首先通过用盐酸调节ALA溶液的pH将其质子化（0.07N HCl、pH＝1.14），并加热至80℃搅拌至溶液澄清为止。随后，将质子化的ALA溶液和粘土混合，并继续再80℃的水浴条件下搅拌半小时，此时的溶液pH约为4.5。之后，合成的绿脱石-有机质复合体（简称为ALA-NAu-2）通过离心的方法收集，并用80℃的超纯水洗涤5次去除任何游离态的以及微弱吸附的ALA分子。

1.2 菌株培养

高温异化铁还原菌ThermusscotoductusSA-01由美国迈阿密大学地质微生物实验室赠送，经甘油冷冻保存于中国地质大学（北京）地质微生物实验室。其是一株兼性厌氧微生物，最早从南非金矿中分离出来（Kieftetal.，1999）。其最适生长温度为65℃，采用TYG培养基培养（5g胰蛋白胨、3g酵母提取物、1g葡萄糖／L）。超高温异化铁还原菌Geoglobus ahangari购买于德国微生物菌种保藏中心，该菌分离自瓜伊马斯盆地热液系统深部2000m处（Kashefietal.，2002），其最适生长温度为85℃，采用DSMZ 1210培养基进行培养。

1.3 微生物还原绿脱石-有机质复合体

首先将原始的绿脱石原土NAu-2及合成的ALA-NAu-2配置成5g／L的溶液。实验采用寡营养培养体系，即体系中只有电子供受体为菌体提供能量来源。高温菌SA-01体系中，乳酸钠（最终浓度20mM）为唯一的电子供体，粘土矿物结构Fe（III）为唯一的电子受体。超高温菌G.ahangari体系中，乙酸钠（最终浓度20mM）为唯一的电子供体，粘土矿物结构Fe（III）为唯一的电子受体。每个还原实验组都另附一组相同条件下添加电子穿梭体AQDS（蒽醌-2，6-二磺酸，最终浓度0.1mmol／L）的实验组。电子穿梭体可以极大地提高微生物还原粘土矿物结构铁的速率。粘土溶液在高温灭菌之后，将生长至对数期的菌体通过离心收集菌体，然后运用吖淀橙对菌体进行染色在荧光显微镜下计数，最后将一定数量的菌体投入反应体系中开始铁还原反应。

1.4 分析方法

1.4.1 结构 Fe（II）检测

对于结构Fe（II）的分析采用氢氟酸／硫酸提取法溶解粘土矿物的硅酸盐结构（Amonette and Templeton，1998）。取0.2mL粘土溶液于装有0.48mL、3.6N H2SO4的黑色避光离心管中，加入 0.08mL、10%的 1，10-phenanthroline显色剂，0.04mL、48%的HF溶液，水浴加热煮沸30min，以促进粘土矿物结构的溶解，然后室温下冷却15min，接着加入0.4mL硼酸溶液中和体系中多余的HF，再取0.1mL样品于1mL 1%的柠檬酸钠溶液中，通过分光光度计在OD＝510nm吸光度下进行检测。

1.4.2 溶解态 Si、Al、Fe浓度测试

实验进一步采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICPOES）对反应及对体系中上清液的溶解态Si、Al、Fe分别进行测试。探究经过微生物的铁还原作用是否会导致粘土矿物的溶解。取粘土矿物悬浊液1mL，离心后将上清液过滤（0.4μm聚醚砜滤膜），将样品稀释到一定倍数之后上机测试。

1.4.3 总有机碳测试（TOC）

TOC（Total Organic Carbon）用来表征粘土矿物中有机碳的总量，可以直观的检测有机质ALA在粘土矿物中的含量变化，探究微生物的铁还原作用对有机质的保存是否有影响。首先在厌氧手套箱中取粘土矿物悬浊液5mL，离心后去除上清液，然后用除氧水洗涤三遍，洗去体系中残留的乳酸钠和乙酸钠。待样品干燥后，取15mg样品上机测试。实验使用德国耶拿总C／N 2100s分析仪，工作温度1000℃。

1.4.4 X射线衍射（XRD）矿物学表征

XRD用于检测ALA插层绿脱石的效果，以及生物还原后插层和未插层的NAu-2在矿物结构上的变化情况。样品采用涂片法制备，粘土溶液在厌氧手套

箱中用除氧水洗涤三遍后，均匀的涂抹于岩相学玻璃片上，于厌氧箱中自然晾干后准备上机测试。仪器的工作条件为：仪器功率8000W（管压40kV，管流200mA），扫描范围3°～15°（2θ），步长 0.02°，扫描速度 0.01°／s。

1.4.5 傅里叶变换红外光谱分析（FTIR）

FTIR可以用来表征有机质ALA进入到粘土矿物层间后及微生物作用后引起的有机质化学键振动变化，并以此可以分析有机质的插层和脱附情况。在厌氧手套箱中取0.5mL粘土溶液样品后，离心后去除上清液，并用除氧水洗涤三遍，待样品在手套箱中自然晾干后，取2mg粉末样品与200mg KBr迅速充分研磨，压片后上机测试。扫描范围为中红外400～4000cm-1，扫描次数50次。

1.4.6 扫描电镜观察（SEM）

SEM用于观察微生物反应前后NAu-2和ALA-NAu-2矿物形貌和元素成分上的变化。具体制样与检测方法如下：将粘土悬浊液样品滴在干净的玻璃载玻片上，以浓度为2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛为固定液对矿物-微生物混合液进行固定。之后将样品放入不同浓度的乙醇（25%、50%、75%、95%、100%）之中进行梯度脱水。处理好的样品放入液态CO2临界点干燥仪（Quorum K850 Critical Point Dryer，CPD）中进行干燥。干燥后的样品放置在SEM样品台上进行喷Pt处理（Quorum SC7620 Sputter Coater）。准备完毕后用SEM（Zeiss Supra 55 SAPPHIRE）对其进行微观形貌的观察，同时利用能谱仪进行矿物化学成分的分析。SEM工作的加速电压为8～15kV，工作距离为15mm。对于形貌观察采用及低电流条件（30～40μA）已达到最好的成像效果。对于能谱分析采用较高的电流（50～70μA）以达到更好的信号强度。

2 实验结果

2.1 绿脱石-有机质复合体的表征

通过扫描电镜结果显示，ALA-NAu-2和NAu-2的微观结构没有太大的区别，都表现出蒙脱石典型的不规则薄片特征，边缘卷曲且互相堆叠（图1a，b），其中ALA-NAu-2碳的含量比NAu-2高，含碳量从不到1%增加至7.455%，间接地说明了ALA与NAu-2相结合（图1a1，b1）。

XRD的结果显示，绿脱石NAu-2经过有机质插层后，合成的有机粘土ALA-NAu-2其层间距从12.389Å增加到16.747Å，表明ALA成功的进入了NAu-2的层间域（图2）。另一方面，ALA-NAu-2相较于NAu-2，其d（001）峰宽变大，表明有机质进入层间降低了粘土矿物片层结构的有序度。

FTIR的结果表明，ALA-NAu-2在原始矿物NAu-2的基础上呈现出了许多新的特征峰，其中包含有机质ALA的特征峰和一些合成过程中新形成的特征峰。如3118cm-1处的N-H伸缩振动峰、2925cm-1和2853cm-1处的C-H反对称和对称伸缩振动峰、1713cm-1处的 C＝O伸缩振动峰、1626cm-1处的O-H变形和N-H弯曲振动峰、1515cm-1处的R-COO-反对称伸缩振动峰、1466cm-1处的CO-H弯曲振动峰以及1400cm-1处的R-COO-反对称伸缩振动峰（图3）。

这些证据共同表明，ALA进入了NAu-2的层间结构，并且ALA的官能团与粘土矿物的片层发生了相互作用。

2.2 微生物还原粘土矿物结构Fe（III）

SA-01与G.ahangari均能够在添加AQDS的情况下迅速地还原NAu-2和ALA-NAu-2中的结构Fe（III）。但是由于G.ahangari本身不能分泌具有类似电子穿梭体性质的物质，因此在不添加AQDS的情况下不能还原结构Fe（III）（结果未显示）。两株菌的还原程度和还原速率都有所不同。SA-01实验组在反应进行了100天时才停止，而超高温菌G.ahangari在反应进行7天的时候还原已经达到平衡，但是实验一直取样到30天，以保证微生物还原反应彻底停止。

图1 NAu-2（a）和 ALA-NAu-2（b）扫描电镜图像及对应的 EDS（a1、b1）谱图Fig.1 Scanning electron microscope（SEM）images of NAu-2（a）and ALA-NAu-2（b）and their corresponding energy dispersive spectroscopes（a1，b1）

图2 NAu-2和ALA-NAu-2 X射线衍射图Fig.2 X-ray diffraction（XRD）patterns of NAu-2 and ALA-NAu-2

SA-01还原绿脱石NAu-2（图4a）前24h反应速率分别为0.04mM／h（不含 AQDS）和0.099mM／h（含 AQDS），还原ALA-NAu-2（图4b）前24h反应速率分别为0.033mM／h（不含AQDS）和0.062mM／h（含AQDS）。反应100天结束时，NAu-2实验组Fe（III）还原程度达到18.48% （不含AQDS）和22.17% （含 AQDS），ALA-NAu-2实验组分别达到14.42% （不含 AQDS）和18.14% （含 AQDS），比 NAu-2实验组反应程度要低。

G.ahangari在都添加了AQDS的情况下，还原绿脱石NAu-2前24h反应速率为0.28mM／h，还原 ALA-NAu-2前24h反应速率为0.15mM／h。反应结束时，绿脱石NAu-2实验组Fe（III）还原程度达到28.56%，有机粘土矿物 ALANAu-2实验组达到23.21%。微生物在还原NAu-2约1.5天后，还原速率急剧下降，还原程度增长幅度减慢直至反应停止，而此时ALA-NAu-2实验组反应仍在持续进行（图4c）。

图3 ALA、NAu-2和ALA-NAu-2复合物傅里叶转换红外光谱图Fig.3 Fourier Transform infrared spectroscopy（XRD）patterns of ALA，NAu-2 and ALA-NAu-2

以上结果说明，微生物对有机粘土矿物ALA-NAu-2的还原程度和还原速率都比粘土矿物NAu-2低，表明有机质进入粘土矿物的层间不利于微生物对结构Fe（III）的还原，这与前人的结果相类似（Zhangetal.，2014；Zengetal.，2016）。

图4 SA-01对NAu-2的还原曲线（a）、SA-01对ALA-NAu-2的还原曲线（b）以及G.ahangari还原NAu-2和ALA-NAu-2的曲线（c）Fig.4 Reduction curves of NAu-2 by SA-01（a），NAu-2 by SA-01（b），and NAu-2 and ALA-NAu-2 by G.ahangari（c）

图5 SA-01（a）和G.ahangari（b）实验体系中总有机碳随时间变化曲线Fig.5 Changes of total organic carbon（TOC）in SA-01（a）and G.ahangari（b）reaction system

表1 可溶性 Si、Al、Fe离子浓度Table 1 Concentrations of soluble Si，Al and Fe

2.3 溶解态 Si、Al、Fe离子浓度

无菌对照实验组中可溶性Si、Al、Fe的浓度都很低（表1）。微生物对NAu-2和ALA-NAu-2结构Fe（III）的还原明显导致了水溶液中溶解态Si、Al、Fe离子浓度的升高。并且可溶性阳离子的浓度随着还原程度的升高而升高。表明微生物对粘土矿物和有机粘土矿物的还原过程中时矿物发生了部分溶解作用。

2.4 TOC结果

高温菌SA-01还原体系中（图5a），NAu-2+细胞和NAu-2+细胞+AQDS实验组其总有机碳含量比对照组略高，这可能来源于实验体系中添加的微生物和培养基中的少量有机碳带入。但是从图5a中可以看出，微生物和培养基中有机碳含量很低，因此相对于ALA-NAu-2的体系来说，几乎可以忽略不计。在有机粘土矿物ALA-NAu-2实验体系中，无菌对照组在65℃下放置100天后，总有机碳含量从7.46%下降到6.80%，表明高温环境下会有少量有机质从粘土矿物层间释放出来，约占总有机碳含量的8.6%；未添加AQDS的微生物实验组，粘土矿物中14.42%的结构Fe（III）被还原，总有机碳含量从7.46%下降到5.64%，表明实验体系中仍有75.60%（剩余有机碳含量／初始总有机碳含量）的ALA保存在粘土矿物结构中；添加 AQDS的实验组，粘土矿物中18.14%的结构Fe（III）被还原，总有机碳含量从7.46%下降到5.75%，实验最终有77.13%的有机质保存在粘土矿物结构中。总体来说，有机质ALA在粘土矿物层间具有很好的稳定性，无菌环境下，即使是在65℃的高温下也能很好的保存下来。微生物对有机粘土矿物进行改造的过程中，尽管一部分有机质从层间释放出来，但是大于75%的有机质依旧保存在粘土矿物结构中。

图6 SA-01（a）和G.ahangari（b）实验体系中ALA-NAu-2 XRD谱图Fig.6 XRD patterns of ALA-NAu-2 in SA-01（a）and G.ahangari（b）reaction system

G.ahangari还原体系中（图5b），有机粘土矿物 ALANAu-2无菌对照组在85℃高温环境下，第一个取样点（0.5天）显示其总有机碳含量直接从7.46%下到5.71%，仅剩76.5%的有机碳保存在粘土矿物层间（剩余有机碳含量／初始总有机碳含量），相比于SA-01的有机粘土矿物无菌对照组反应结束时仍有91.4%保存在矿物结构中，说明更高的温度会进一步促进ALA的释放。当ALA-NAu-2无菌对照组在高温环境下释放出一部分有机质后，直至微生物反应停止30天时，其所含的有机质含量为5.6%，占原始总有机碳含量的75.1%，相比于第一个点的测量值5.71%，此过程中仅有0.11%的有机碳释放出来。总体来说，当有机粘土ALANAu-2在放置于85℃环境下，一些表面或是层间吸附不牢固的ALA会立刻从粘土矿物中释放出来，剩余大于75%的有机质仍然与粘土矿物之间有很强的吸附，二者存在的状态稳定并且不受高温的影响。

从G.ahangari还原有机粘土ALA-NAu-2的曲线（图4c）可以看出，随着微生物对结构Fe（III）还原程度的升高，有机质ALA不断从粘土矿物的层间释放出来。当微生物还原停止时，有机质的含量也不再下降，并且保持稳定。由于微生物的还原能力有限，实验最终仍有4.54%的有机质被保存下来，占据初始总有机碳含量的60.9%。总之，在温度稳定之后，微生物的铁还原作用会进一步导致一部分有机质继续从粘土矿物层间释放出来，但是受限于较低的铁还原程度，最终仍然有大于60%的有机质保存在粘土矿物中。

2.5 XRD结果

SA-01还原有机粘土前后XRD谱图（图6a）显示，经过微生物的铁还原作用后，有机粘土矿物的d（001）从16.747Å的单峰转变为16.849Å和13.842Å的双峰。其中16.849Å处的峰比原始ALA-NAu-2主峰16.747Å变得更加尖锐。而13.842Å的峰与没有插层的绿脱石d（001）值接近，呈现出NAu-2的特征。表明在微生物还原有机粘土矿物ALA-NAu-2的过程中，一部分的ALA会从层间结构中脱附出来，最终导致层间距减小，并接近于插层前的层间距。

G.ahangari还原有机粘土前后XRD谱图（图6b）显示，置于85℃环境下的对照组ALA-NAu-2相对于原始ALANAu-2，其层间距d（001）从16.849Å降至13.779Å，层间距减小，表明更高的温度会促进更多ALA从粘土矿物的层间释放出来，这一结果与总有机碳测试结果相吻合（图5b）。加入微生物G.ahangari的实验组，ALA-NAu-2的 d（001）从16.747Å降至13.142Å，与没有插层的绿脱石 d（001）值接近，呈现出NAu-2的特征。另外，相对于无菌对照实验组，经过微生物还原后的有机粘土矿物峰变的更加尖锐，且峰强增大，说明经过微生物作用后绿脱石的结晶程度有所提高，在反应过程中小颗粒与结晶度较差的绿脱石可能优先发生溶解。

2.6 FTIR结果

FTIR的结果显示，两株细菌的铁还原作用均对ALA与NAu-2的结合产生了一定影响，但是两株菌之间还有一定差异。依照前人对绿脱石NAu-2的红外光谱的分区经验（Neumannetal.，2011），将有机粘土矿物 ALA-NAu-2的红外光谱分为5个区域：3800～3200 cm-1、3200～2500 cm-1、1800～1500 cm-1、1200～900 cm-1和 1000～700cm-1，分别指示蒙脱石八面体结构中νM-OH（M代表八面体片中的Mg、Al或Fe）伸缩振动带，C-H伸缩振动带，O-H变形振动带，Si-O伸缩振动带以及八面体中νM-OH弯曲振动带。

图7 对照组及SA-01还原后ALA-NAu-2红外谱图Fig.7 FTIR patterns of control group and reaction group by SA-01

ALA-NAu-2经过SA-01的还原后，峰强都有明显的减弱，但是峰位没有太大的偏移。3563cm-1处的νM-OH伸缩振动峰在ALA-NAu-2还原后峰位移到3571cm-1，3432cm-1处为吸附水峰。图7b中显示的是有机质ALA特有的C-H伸缩振动峰，经过微生物作用过后峰强略有减弱，表明即使微生物对粘土矿物结构Fe（III）进行还原，仍然有一部分有机质存留在粘土矿物的层间。图7c中的O-H变形振动峰在还原后也略微减弱，图7d中1115cm-1处的Si-O峰经微生物作用后基本消失，1033cm-1处的Si-O峰强度减弱，峰形变得宽缓，且略微出现偏移。νM-OH变形振动带（图 7e）在875cm-1、845cm-1、821cm-1、787cm-1分别指示 AlFe-OH、AlMg-OH、FeFe-OH以及FeMg-OH振动峰，还原后该区的峰都明显减弱，875cm-1处的峰几乎消失。总体来说还原作用对ALA-NAu-2矿物结构内化学键振动也产生了一定影响。

与SA-01相比，经G.ahangari作用前后红外谱图显示，还原后的ALA-NAu-2峰的位置也未发生太大偏移，但是峰强的减弱更为明显，有些甚至消失不见。图8a中3563cm-1处的νM-OH伸缩振动峰在还原反应后几乎消失。图8b中有机质ALA的C-H伸缩振动峰，经过微生物作用过后峰强明显减弱更加明显，但是峰形并没有完全消失，表明微生物还原结束后，仍有部分有机质保存在粘土矿物的层间。图8c中的O-H变形振动峰在还原后略微减弱，图8d中1115cm-1处的Si-O峰经微生物作用后基本消失，1038cm-1处的Si-O峰强度减弱，峰形变得宽缓。图8e中νM-OH变形振动带还原后该区的峰都明显减弱，880cm-1处的峰几乎消失。总体来说与 SA-01相似，ALA-NAu-2经过G.ahangari作用后ALA的特征峰及矿物结构内化学键振动也发生了明显的变化。

图8 对照组及G.ahangari还原后ALA-NAu-2红外谱图Fig.8 FTIR patterns of control group and reaction group by G.ahangari

2.7 SEM结果

SEM的结果显示，经过微生物还原的NAu-2，表面转变成疏松多孔的絮状物，并呈现出凌乱的网状结构（图9a）。EDS（图9b）显示，经过微生物作用后的矿物，其Fe含量有所降低，有机粘土矿物经微生物作用后，有机碳的含量也有所降低，这一结果与TOC、XRD的结果都有很好的对应关系。

SA-01对ALA-NAu-2还原后，由于粘土矿物结构被破坏，矿物发生还原溶解和再沉淀反应，在扫描电镜下观察到一系列粘土矿物溶解所产生的纳米SiO2聚合物（图9c）。

3 讨论

3.1 有机质对微生物还原粘土矿物的影响

图9 还原后NAu-2（a）、ALA-NAu-2（b）和新矿物纳米二氧化硅（c）扫描电镜图像及其对应的EDS谱图（a1、b1、c1）Fig.9 SEM images and corresponding EDSof reduced NAu-2（a），ALA-NAu-2（b）and newly-formed nanosized silica and their corresponding energy dispersive spectroscopes（a1，b1，c1）

从高温菌SA-01和超高温菌G.ahangari还原粘土矿物、有机粘土矿物的结果来看，二者均能对NAu-2和ALANAu-2中的结构Fe（III）进行还原，由于两种粘土矿物的性状不同，致使ALA-NAu-2的还原程度和还原速率均比NAu-2要低。这可能有以下几个原因：首先质子化的ALA可以通过置换绿脱石NAu-2的阳离子和层间水，从而进入粘土矿物的层间。目前的研究指出，一些具有铁还原功能的微生物类群在还原粘土矿物结构铁的过程中，其电子传递的方式主要通过平行于粘土矿物d（001）结构层的方向进行（Zhaoetal.，2015；Shietal.，2016）。即微生物首先会还原粘土矿物片层边部八面体片中的结构Fe（III），而后电子不断以平行于d（001）面的方向向粘土矿物内部传输。一些研究也通过模型计算方法证明了，相比于通过四面体片层的垂直d（001）方向的电子传递途径，这种电子传递方式更容易实现（Alexandrovetal.，2013）。但是，还是有部分研究表明，在添加了电子穿梭体AQDS的情况下，微生物还原过程中电子也可能通过垂直 d（001）片层的方向传输（Bishopetal.，2014）。这种垂直d（001）片层的电子传递方式在一些铁含量较低的蒙脱石矿物中也被发现（Lattaetal.，2017）。ALA作为一种烷基类有机质，其导电能力要远弱于金属离子。因此当ALA通过取代了粘土矿物层间的阳离子占据了层间域后，会更加不利于电子在垂直于d（001）片层的方向传输。并且ALA插层后粘土矿物的层间距明显增大，显然也不利于电子通过层间域在这个方向的传输。

另一方面，质子化的ALA还可能取代粘土表面的阳离子而吸附于其表面，还原过程中脱附的ALA也可能通过该方式附着于粘土表面，因此同样也不利于电子在平行于d（001）的方向上传播。考虑到质子化的ALA带正电，而细菌细胞膜带负电，因此脱附的ALA也可能覆盖在微生物的表面，从而抑制了微生物的代谢活动，降低其铁还原的速率。综合来看，粘土矿物表面和层间吸附的有机质对结构Fe（III）还原程度和还原速率的降低都起着很重要的作用。因此微生物对ALA-NAu-2结构Fe（III）的还原程度和速率都要比NAu-2要低。

3.2 微生物作用下有机粘土矿物的转变

微生物可以通过破坏矿物结构获取自身新陈代谢和生长所需的能量和营养物质。因此，矿物在微生物的调控下会发生溶解、沉淀与转化，在一些条件下甚至会产生一些新的矿物，如白云石、无定形二氧化硅、菱铁矿甚至一些自然元素等（Konhauser，2007；Dongetal.，2009）。本文实验结果显示，高温菌SA-01在对ALA-NAu-2结构Fe（III）进行还原的过程中，随着还原程度的升高，有机粘土矿物结构发生溶解，同时生成了一些纳米二氧化硅颗粒，而ALA的存在对于次生矿物的产生并没有明显影响。

之前有研究表明，粘土矿物层间插层的有机质的种类从某种程度上决定了微生物的还原程度（Zhangetal.，2007）。如果插层的有机质可以作为营养物质被微生物利用或是作为电子穿梭体存在于实验体系中，将会提升微生物对Fe（III）的还原程度，并且可以促进粘土矿物的转变。如果插层的有机质对微生物具有毒害作用，比如甲苯，微生物的还原作用将会受到抑制，而粘土矿物也不会发生转变。本文中所用的有机质ALA既不能被微生物作为营养物质利用，也不能作为电子穿梭体而存在，对微生物也没有毒害作用，因此微生物铁还原作用所导致的矿物转变几率不大。

3.3 粘土矿物中有机质的释放机制

综合分析高温菌SA-01和超高温菌G.ahangari实验组TOC随时间变化曲线可以看出，有机质的释放主要受两个因素的影响，即结构Fe（III）的还原程度和温度（图4、图5）。

溶解态Si、Fe浓度测试结果和还原后 ALA-NAu-2的SEM-EDS谱图证实微生物在对粘土矿物进行还原时，粘土矿物结构发生还原溶解（表1、图1b、图9b），这是一部分有机质从粘土矿物层间释放出来的主要原因。随着微生物对有机粘土矿物ALA-NAu-2结构Fe（III）还原程度的升高，少量有机质陆续从粘土矿物的层间释放出来，当微生物还原停止时，有机质的含量也不再发生变化，二者呈正相关关系。由于微生物还原能力有限（还原程度＜30%），总体来说有机质仍会在粘土矿物层间得到很好的保存。并且由于微生物优先还原粘土结构边部的Fe（III），并且采取从边缘向中心蔓延的方式进行还原，因此，当微生物还原停止时，位于ALANAu-2中心位置的有机质仍能很稳定的存在于粘土矿物结构中，而边缘位置由于发生还原溶解，或是还原后产生离子半径更大的Fe（II）挤压粘土片层，造成结构的不稳定，该部位的有机质很有可能被释放出来，层间距减小，恢复到插层前NAu-2的状态，这就解释了ALA-NAu-2经SA-01还原后XRD谱图出现双峰的原因（图6a），这与我们之前的研究结果也相似（Zengetal.，2016）。

另一方面，虽然高温无菌环境也会导致少量ALA自发地从粘土矿物层间释放出来，例如65℃下时，有机质释放了0.66%，占总有机碳含量的8.6%；85℃下时，有机质释放出了1.75%，占总有机碳含量的23.5%。这说明温度高可能会由于热力学作用造成一些弱结合态的ALA的脱附。但是在温度稳定之后，微生物的铁还原反应对粘土矿物造成的还原性溶解或是结构的畸变仍是ALA释放的主要原因。因此，针对一些结构铁含量不高的膨胀性粘土矿物如蒙脱石，微生物铁还原作用机制弱更弱，那么层间域对有机质保持作用应该更强。

3.4 粘土矿物保存有机质的环境及地球化学意义

尽管众多的前人研究发现不同类型的矿物对有机质的吸附会有效地降低有机质的矿化速率，从而对有机质起到一定的保存作用（Lützowetal.，2006；Keil and Mayer，2013），但是对于粘土矿物的可膨胀层间域作为有机质保存的场所的相关研究却甚少。这可能与现今有限的检测技术手段有所关系。因为对于检测和表征矿物表面吸附态的有机质较为容易，而对于粘土矿物层间域中的填充有机质的定性定量研究相对较难。例如粘土矿物的d（001）层间距可以根据含水量，层间阳离子类型的不同从几埃到十几埃之间发生变化，因此单纯依靠XRD确认天然样品中的层间有机质填充十分困难。并且由于粘土矿物颗粒细小和非均一性较大，一些常规的谱学方法也不容易区分表面、边部吸附的有机质和填充在层间域中的有机质。虽然高分辨的透射电子显微镜已经能够较为清晰地观测到粘土的片层结构（Zhaoetal.，2017），但是在电镜的相关配件上（如X射线能谱、电子能量损失谱）还达不到对有机质进行精细鉴定的程度。因此在天然样品中粘土矿物层间有机质的定性和定量研究上还存在一定的技术空白。

但是我们通过实验室的模拟研究发现，一些具有特定官能团的有机质能够进入粘土矿物的层间域，并且能够在较高的温度下和微生物的铁还原作用中保存下来。这填补了我们在常温至中温条件下发现类似现象的空白。对于自然界中是否存在有机质填充在层间域的粘土矿物，我们从理论层面将其扩大到了更广的温度范围，但是未来还需要更多的工作去对天然样品进行定性定量的表征。

另外粘土矿物的层间域还具有大量的酸性位点，因此被认为是催化有机质生烃的重要场所（Yuanetal.，2013）。而有机质的催化生烃往往需要较高的温度，我们的结果也证明了即使在高温条件下有机质也能够相对有效地保存在粘土矿物的层间域，这为粘土矿物与油气生成和埋藏之间的关联进一步提供了理论依据。

4 结论

通过对一种插层态的有机质-粘土矿物复合体的微生物铁还原结果显示，温度和铁还原作用是控制有机质从粘土矿物层间脱附的主要因素，随着温度和铁还原程度的升高，会有少量有机质从粘土矿物层间脱附出来，但是大部分的有机质仍保存在层间。说明即使在高温条件下粘土矿物的可膨胀层间域也能够有效地保存一些具有特殊官能团的有机质。这对极端环境下粘土矿物对有机质的保存作用提供了更多理论依据。

致谢 感谢中国科学院广州地球化学研究所袁鹏研究员对有机质-粘土矿物复合体合成方面的支持。

谨以此文恭贺叶大年院士八十华诞。