核纤层蛋白A翻译后修饰研究进展

廖自强，牛海涛，王清水，林尧

福建师范大学 生命科学学院，福建 福州350100

真核生物细胞核包含核孔复合物、核基质、核纤层等成分。核纤层是核纤层蛋白（lamins）在内核膜的核浆面形成的致密蛋白质网状结构[1]，主要功能是维持细胞核的形态结构，调节核孔复合物之间的间隔[2]，对核组装、细胞凋亡、细胞信号转导、DNA 修复等细胞功能具有重要作用[3-6]。蛋白质翻译后修饰是调节蛋白质结构功能的一种重要修饰方式，是受到严格调控的一个过程。真核生物中包含至少20种不同的蛋白质翻译后修饰，如泛素化、SUMO（small ubiquitin-related modifier）化、磷酸化、法尼基化、甲基化等。核纤层蛋白A 作为一种重要的细胞核骨架蛋白，翻译后修饰对其功能具有较大影响。因此，本文主要概述核纤层蛋白A的翻译后修饰相关研究进展。

1 核纤层蛋白A的结构与功能

核纤层蛋白是存在于细胞核内的V 型中间丝（intermediate filament，IF），具有高度保守的结构域，包括N端球状区域、位于中部的α螺旋杆状域、C端球型尾部区域。α螺旋杆状结构域由L1、L12、L2 结构域分为4 段区域，即1A、1B、2A和2B。2B 结构域后面有一个核定位信号域（nucle⁃ar localization signal，NLS），是核纤层蛋白进入细胞核所必需的定位信号[7]。C端与核定位信号之间有一个免疫球蛋白样模序（Ig-fold）。哺乳动物的核纤层蛋白分为A 型（LMNA）和B 型（LMNB），A 型核纤层蛋白主要包括核纤层蛋白A、AΔ10、C、C2，B 型核纤层蛋白主要包括核纤层蛋白B1、B2，其中A、C、B1和B2 是核纤层蛋白的主要组成部分[8-9]。LMNA基因包含12个外显子，核纤层蛋白A在第10个外显子处进行剪切形成核纤层蛋白C。核纤层蛋白A和C的N端566个氨基酸残基相同，核纤层蛋白C 缺少部分10 号外显子和11、12 号外显子编码的氨基酸序列[10]。核纤层蛋白A 前体的C端尾部是由18个氨基酸残基组成的包含CAAX 模序的特殊结构。

2 核纤层蛋白A的翻译后修饰

翻译后修饰对核纤层蛋白A的功能具有重要作用，能影响核纤层蛋白A的稳定性、亚细胞定位、与DNA的结合及与其他蛋白质的相互作用等。目前研究表明，核纤层蛋白A有多种翻译后修饰，如法尼基化、SUMO 化、泛素化、磷酸化等。

2.1 核纤层蛋白A的法尼基化修饰

蛋白质的异戊二烯化修饰广泛存在于真核细胞中，主要分为牻牛儿酰牻牛儿基化修饰和法尼基化修饰[11]。核层蛋白A 前体需要进行法尼基化修饰才能形成成熟的核纤层蛋白A。核纤层蛋白A 前体的C端（-CSIM）是CAAX 模序，可以引发法尼基化修饰。首先，法尼基蛋白转移酶（FTase）识别核纤层蛋白A 前体尾端的-CSIM 序列，将聚异戊二烯基团连接到半胱氨酸的硫醇基上；然后，C端的3个氨基酸残基SIM 被金属蛋白酶ZMPSTE24（zinc metalloproteinase Ste24）和RCE1（Ras and α-factor converting enzyme）单个或者2个酶共同作用剪除，这2个酶在剪切过程中哪个起主要作用尚未确定[12]；下一步，结合在半胱氨酸上的聚异戊二烯基团在内质网中被异戊烯半胱氨酸羧基端甲基转移酶（isoprenylcysteine carbox⁃yl methyltransferase，ICMT）进行甲基化修饰[13]；最后，核纤层蛋白A 前体在金属蛋白酶ZMPSTE24的作用下切除包括法尼基化和羧甲基化半胱氨酸在内的15个C端氨基酸残基（647～661 aa），最终形成成熟的核纤层蛋白A（1～646 aa）[14]。

核纤层蛋白A 前体C端的-CSIM 发生法尼基化修饰后使C端疏水性更强，可以更好地定位和保留在核内膜；然而核纤层蛋白C 不包含CAAX结构，但是也可以定位在核膜。因此，法尼基化修饰化可能并不是核纤层蛋白A 定位到核膜不可或缺的过程[15]。核纤层蛋白A 一旦定位到核膜，就被酶进一步加工除去C端包括法尼基团在内的18个氨基酸残基，然而B 型核纤层蛋白一直保持法尼基化的状态。法尼基化修饰过程较快，一般无法检测到该过程。

2.2 核纤层蛋白A的SUMO 化修饰

SUMO 是广泛存在于真核生物中的类泛素多肽，目前在哺乳动物中已发现4种SUMO基因，即SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3、SUMO-4[16-17]。SUMO化作为一种类泛素化修饰，其反应过程是一种与泛素反应过程相似的级联反应，修饰过程一般由3种酶催化，即E1 激活酶、惟一的E2 结合酶UBC9（ubiquitin-conjugating 9）和E3 连接酶。SUMO 化修饰可以调节蛋白的稳定性、蛋白的亚细胞定位，干扰蛋白间的结合，改变蛋白的构象而暴露或隐藏与其他蛋白结合的位点等[18-19]。SUMO 化是一个动态可逆的过程，SUMO的特异性蛋白酶（sentrin/SUMO-specific protease，SENP）可将SUMO与修饰的蛋白从结合状态解离，称为去SUMO 化。

Zhong 等[20]用酵母双杂交系统检测到核纤层蛋白A与UBC9 存在相互作用关系，暗示核纤层蛋白A 可能存在SUMO 化修饰。Zhang 等[21]在HeLa细胞中，用核纤层蛋白A 抗体免疫共沉淀内源SUMO1、SUMO2/3，检测到SUMO2/3 可以与核纤层蛋白A 发生共沉淀，所以核纤层蛋白A 可能与SUMO2/3 结合发生SUMO 化修饰，通过对核纤层蛋白A 序列的分析，在高度保守的杆状区域K201位置预测到SUMO的识别与结合模序MKXE（rep⁃resents hydrophobic amino acids），对K201 进行突变（K201R），检测结果显示SUMO2/3与突变后的核纤层蛋白A 共沉淀明显变少，进一步对结合模序MKXE的E 进行突变（E203G，E203K），发现E位点突变后与K201 突变具有相似效果，共沉淀也明显减少，所以MKXE 模序对SUMO 化修饰具有重要作用。此外，K201R、E203G、E203K 位点单独突变后进行荧光定位检测，发现大量核纤层蛋白A 聚集成点位于细胞核内或核周，并且检测到突变后促进细胞的凋亡，说明SUMO 修饰位点突变后影响核纤层蛋白A的定位和凋亡。

Simon 等[22]在Cos-7细胞中发现核纤层蛋白A能与SUMO1和SUMO2 结合，体外实验检测结果表明SUMO1 对核纤层蛋白A 尾部区域的亲和性比SUMO2 更强。通过多个SUMO 化修饰预测软件比对选出潜在的核纤层蛋白A 尾部区域SUMO修饰的位点，分别对筛选到的位点进行点突变后做共沉淀实验，结果显示只有K420 位点突变成R后与SUMO1的结合明显变少，同时对非SUMO 识别序列位点K486 进行点突变后通过共沉淀实验也发现SUMO1 结合减少。因此有观点提出，K486能与SUMO 结合的原因可能是因为该位点处由多个酸性残基形成一个UBC9 识别的位点。

Sharma 等[23]在MEFs细胞中用免疫共沉淀方法检测到去SUMO 化酶SENP1 可以与核纤层蛋白A 结合，在SENP1表达缺失的MEFs细胞中核纤层蛋白A表达量上升。而且已有报道核纤层蛋白A蛋白可以被SUMO 化修饰，因此SENP1表达的缺失可能是由于去SUMO 化作用的减少导致核纤层蛋白A表达上升。

2.3 核纤层蛋白A的泛素化修饰

泛素是广泛存在于真核细胞中的由76个氨基酸残基组成的高度保守蛋白。将泛素传递到靶标蛋白进行结合需要泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）的参与，这3种酶进行级联反应将泛素进行传递，最终泛素才能与靶标蛋白进行结合和标记[24]。泛素标记的靶标蛋白可通过26S 蛋白酶体进行降解[25]，介导真核生物体内80%～85%的蛋白质降解；或者不经过26S 蛋白酶体作用，改变靶蛋白的构象和功能，调节其定位和分布[26]。蛋白质的泛素化是动态、可逆的结合修饰过程。靶蛋白上的泛素可被去泛素化酶（deubiquitin，DUB）作用脱离，称为去泛素化。

Sharma 等[23]在MEFs细胞中加入蛋白酶体抑制剂MG132，检测内源核纤层蛋白A 蛋白的表达。当加MG132后，与未加的MEFs细胞相比核纤层蛋白A的表达明显上升。并且在SENP1突变、SUMO1突变、SUMO1和SENP1同时突变的MEFs细胞中加入MG132后，核纤层蛋白A的表达均有上升。因此，核纤层蛋白A 可能受到泛素的修饰进而发生泛素-蛋白酶体途径的降解。采用高通量质谱分析方法，Wagner 等[27]利用HEK293T细胞、Kim 等[28]利用结肠腺癌细胞CT116，均检测出核纤层蛋白A 潜在的多个泛素化位点。

2.4 核纤层蛋白A的磷酸化修饰

蛋白质发生磷酸化主要是由蛋白质激酶催化作用将ATP 或GTP的γ位磷酸基转移至特定底物蛋白氨基酸残基的过程[29]，是一种在生物体内广泛存在且非常重要的翻译后修饰方式，细胞内超过30%的蛋白质可发生磷酸化修饰。

核纤层蛋白A 含有多个保守的激酶识别位点，可被多种激酶磷酸化。目前发现的核纤层蛋白A的磷酸化位点已经超过30个，有些磷酸化位点在细胞有丝分裂期间发生磷酸化，伴随着核纤层蛋白多聚体的解聚，最终导致核膜的裂解。在细胞分裂间期，磷酸化会被磷酸化酶进行去磷酸化反应，这使得解聚的核纤层蛋白重新聚合形成致密内核膜结构[30]。核纤层蛋白分解和聚集依赖磷酸化和去磷酸化，这是细胞周期过程细胞核的保守功能。

周期蛋白依赖性激酶CDK1 可以分别磷酸化核纤层蛋白A 位于N端区域的S22和尾部区域的S392，有研究表明这2个位点其中一个发生磷酸化就足以使核纤层蛋白A 发生解聚[31-32]。HeLa细胞中用磷酸化特异性抗体检测结果表明，有丝分裂过程中核纤层蛋白T19、S22、S393和S636 位点的磷酸化增加2～6倍[33]。也有报道其他激酶也可以磷酸化核纤层蛋白A 位点导致解聚[34-35]。核纤层蛋白A的S404 同时是PKC和AKT 这2个蛋白激酶的磷酸化位点，PKC 激酶磷酸化核纤层蛋白A 可以促进其进入细胞核[36]。将核纤层蛋白A的S403和S404 位点进行突变，即突变后位点不能发生磷酸化（S403A和S404A），突变后发现可以抑制其进入细胞核，所以磷酸化可以影响核纤层蛋白A在细胞内的定位[34,37]。在生理条件下AKT 可以使核纤层蛋白A的S301和S404 位点发生磷酸化，而且核纤层蛋白A 前体S404 位点发生磷酸化后可促进其前体蛋白的降解。将外源核纤层蛋白A 前体的S403和S404 位点进行突变，即突变模拟发生磷酸化（S403D和S404D），突变后发现核纤层蛋白A 前体主要分散在细胞质中，所以磷酸化影响核纤层蛋白A 前体的细胞定位[38]。PKC 家族成员磷酸化核纤层蛋白A 除了可以使核膜裂解外还具有其他功能，如核纤层蛋白A的Ig-fold区域的S525只在细胞分裂间期才发生磷酸化，所以并不参与细胞核的分裂调控[37]。核纤层蛋白A的S404 可以被S6-kcinaseⅡ磷酸化[39]，并且在各种细胞中该位点都有被修饰的情况，但是功能还不清楚。

3 核纤层蛋白A 翻译后修饰之间的相互作用

蛋白质的翻译后修饰在生命活动过程中发挥着关键的调节作用，该过程的异常将直接影响蛋白质功能的正常执行，从而引发相关疾病甚至癌症。核纤层蛋白A的翻译后修饰可能作用于同一氨基酸残基，也可能因为修饰后改变蛋白的构象或定位而影响其他的翻译后修饰过程。

Sharma 等[23]在MEFs细胞中将已报道的核纤层蛋白A的3个SUMO 化修饰位点进行点突变（核纤层蛋白A-3KR），与未进行突变的核纤层蛋白A 分别转染野生型MEFs细胞和SENP1 突变的MEFs细胞，检测核纤层蛋白A的表达。与转染未突变的核纤层蛋白A 相比较，在MEFs细胞中转染核纤层蛋白A-3KR后，核纤层蛋白A-3KR表达下降；与转染未突变的核纤层蛋白A 相比较，在SENP1 突变的MEFs细胞中转染核纤层蛋白A-3KR后，核纤层蛋白A-3KR的表达也是下降的。因此，SUMO 化修饰对核纤层蛋白A在野生型和SENP1 突变型MEFs细胞中都具有稳定核纤层蛋白A表达的功能。在野生型MEFs细胞和SENP1突变的MEFs细胞中分别转染核纤层蛋白A 或核纤层蛋白A-3KR，SENP1 突变的MEFs细胞中核纤层蛋白A的表达都较高。因此，SENP1的缺失可以提高核纤层蛋白A的表达，同时核纤层蛋白A 可能还含有别的SUMO 化修饰位点。在野生型MEFs细胞和SENP1 突变的MEFs细胞中加入蛋白酶体抑制剂MG132，可以提高内源核纤层蛋白A蛋白的表达。核纤层蛋白A 可能会受到泛素的修饰进而发生泛素-蛋白酶体途径的降解，所以核纤层蛋白A 进行SUMO 化修饰可能具有保护其不被泛素蛋白酶降解的功能。核纤层蛋白A 作为V 型中间丝，与其他中间丝蛋白结构具有一定的保守性（杆状结构域高度保守），特别是其N端的16个氨基酸残基和C端的30个氨基酸残基的保守性最高[40]。已经有报道，高磷酸化的中间丝蛋白经常伴随泛素化的发生，有观点提出磷酸化的存在可能具有招募泛素连接酶的能力，因此磷酸化和泛素化之间存在的机制须进一步探讨[41]。此外，也有报道中间丝蛋白的泛素化与蛋白酶体抑制剂具有一定关系[42]。

4 结语

核纤层蛋白A 作为核骨架蛋白维持细胞核结构功能形态的稳定，有研究发现其表达变化不仅能影响细胞核的可变形性，也能影响癌细胞的迁移功能。核纤层蛋白A 翻译后修饰的过程受到一系列酶的严格调控，翻译后修饰影响其表达、定位以及与其他蛋白的相互作用等。然而核纤层蛋白A的翻译后修饰在细胞中的功能，以及核纤层蛋白A 各种翻译后修饰之间的相互作用关系都亟需深入挖掘。进一步开展核纤层蛋白A的翻译后修饰研究，对于深入探究细胞核结构功能的稳态具有重要意义。