环状RNA在胃癌中的研究进展

曹博，丁丽华，卫勃

1.解放军总医院第一医学中心 普通外科，北京100853；2.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100850

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率居世界第四，肿瘤相关死亡率位居世界第五[1]。我国是胃癌的“重灾区”，发病率、死亡率居高不下[2]。由于我国医疗资源分布不均衡，胃癌早期筛查普及率低，多数患者就诊时已处于进展期，手术治疗难以实现根治，转移率高，预后差。特别是由于饮食结构改变及社会压力增加，近年来胃癌发病呈现出年轻化的倾向，并且青年患者肿瘤具有侵袭性强、体积大、分化程度低等恶性生物学特点[3]。胃癌作为具有鲜明地域特色的恶性肿瘤，给患者带来极大的精神和身体负担，严重制约我国经济和社会发展。因此，挖掘具有高度临床价值的早期诊断标志物、预后判断参考值和个体化治疗靶点迫在眉睫。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是非编码RNA 家族的重要成员。与传统线性RNA的5'、3'端结构不同，circRNA 呈现连续的共价闭合环状。1976年，Kolakofsky 首次在植物病毒内探测到circRNA[4]，1979年Hsu 等在真核细胞中也发现了circRNA[5]，其后相当长的时间，circRNA 一直被认为是基因表达的“噪音”，不具备生理功能[6-7]。随着分子生物学技术的快速发展，circRNA的调控能力被逐渐揭示，对其产生机制的探索也有长足进步。Jeck 等利用高通量测序、生物信息学分析等技术，提出了circRNA 产生的2种方式，即套索驱动的环化模型和内含子配对驱动的环化模型[8]。这一报道为剖析circRNA的来源与功能研究奠定了坚实的基础。研究证明，多系统疾病的发生和进展与circRNA 异常表达密不可分[9-11]。胃癌与circRNA的关系研究作为新兴的热点，近年来出现“井喷式”增长，临床转化潜力不可估量。

1 circRNA 简介

1.1 circRNA的生物学功能

circRNA的生物学调节功能可归为4 类：作为“分子海绵”与microRNA（miRNA）互补结合，抑制其生物学功能[12-13]；与RNA 结合蛋白（RNA bind⁃ing protein，RBP）相互作用，影响RBP的相关信号通路[14]；在细胞核内与RNA 聚合酶结合，顺式调控亲本基因转录[15]；作为模板直接编码蛋白[16]。目前主要的研究热点集中于circRNA的“分子海绵”吸附功能，极大地丰富了RNA 调控网络。除单个circRNA的机制研究以外，基于生物信息技术的疾病circRNA-miRNA调控网络也在如火如荼地构建中[17-19]，为后续关键性circRNA的筛选提供理论支撑。编码功能的发现颠覆了科学界对于非编码RNA的传统认知。新近发现，胃癌细胞系内circFNDC3B 存在开放读框，表达25kD的肽链[20]，这提示circRNA的生物学调节方式不仅局限于转录后水平调节，大量未知功能有待探索。

1.2 circRNA的特点

circRNA的生物学特性如下：①稳定性。反向拼接而成的连续、闭合环状结构使circRNA 对RNA 核酸外切酶的降解不敏感[21]。circRNA 稳定存在于多种极端环境，如尿液、胃液中，是临床非侵袭性诊断方式的适宜标志物。②半衰期长。circRNA的半衰期通常大于48 h[6,8]，探测结果稳定，具有参考性。③保守性。真核细胞circRNA具有高度保守的位点[22]，极大提升了稳定干扰疾病相关circRNA表达水平的可行性。所以，凭借结构和功能的独特优势，circRNA在胃癌的临床诊治中具有极大的潜力。

2 circRNA与胃癌诊断

circRNA在胃癌细胞和正常细胞内的含量均相对较高，某些circRNA与线性RNA 亚型水平相当，甚至与其线性mRNA 相比可升高10倍以上。所以，circRNA在病理组织内的表达差异具有可探测性，尤其是随着微滴式数字PCR 等新式技术的出现，某些极端环境下的痕量circRNA 也能实现精准探测。性状的稳定性、表达的差异性、探测的可行性均赋予circRNA 高度的临床诊断潜力。近年来，许多课题组对胃癌及癌旁组织的表达谱进行了比对分析，筛选出一批差异显著的circRNA，如circ_101504、circ_0026 等[23-24]，为后续推动临床诊断应用提供了理论依据。一项Meta分析汇总了11 项有关胃癌组织和血液circRNA的诊断研究，综合曲线下面积（area under curve，AUC）达0.81，综合灵敏度和特异度均大于0.7[25]，提示circRNA 具有出色的胃癌诊断转化潜力。

2.1 胃癌组织的circRNA

大部分研究集中于胃癌组织内circRNA表达水平的探测及其临床诊断意义的解析，效能判断仍然沿用经典的灵敏度、特异度及AUC 比较。表达差异较大的circRNA 集中位于chr1、chr2、chr3、chr9和chr17[26]，提示此类染色体相关基因可能在胃癌的发生和进展中存在机制关联。目前胃癌组织内诊断价值最高的circRNA 为circ_0001017，其在胃癌组织内的表达明显下调。对于区分不典型增生和正常组织方面，circ_0001017的灵敏度和特异度可达79.4%和81.1%，AUC值为0.871[27]，是诊断癌前病变的潜在标志物，为胃癌的早期筛查提供了新的思路。Li 等[28]分析了circ_002059的诊断价值，在区分胃癌和正常组织方面，其灵敏度、特异度和AUC值分别为0.81、0.62和0.73。该团队进一步探测了不同温度对应不同储存时间下circ_002059的水平，结果显示无明显差异，进一步佐证了circRNA的高度稳定性，可作为理想的胃癌诊断标志物。此外，circ_0003159、circ_0000190 等也被证明是潜在的胃癌诊断靶点[29-30]。

除鉴别异常组织外，许多circRNA与胃癌患者的临床病理特征具有显著相关性，可协助临床医师正确判断病情和制定治疗方案。胃癌组织内circ_0074362 低表达与淋巴结转移存在关联[31]，可为术中冰冻病理判断患者淋巴结受累程度、确定下一步手术方案提供参考。Shao 等[26]发现circ_0014717与多种临床病理特征显著相关，包括肿瘤分期、远处转移、经典肿瘤标志物表达水平等，提示circ_0014717 具有评估患者病情、提升经典肿瘤标志物诊断效能的潜力。

2.2 血液circRNA

依靠血液肿瘤标志物诊断癌症是研究热点之一。采集血液样本的方式温和，属于非侵袭性手段，患者接受度较高，适宜用于癌症的早期诊断和术后病情监测。目前临床常见的血液肿瘤标志物包括CEA、CA19-9、CA12-5 等[32]，但是其种类冗杂，灵敏度和特异度均不理想，当各项指标变化趋势不一致时，临床医师很难根据结果进行正确判读，无法满足胃癌早期诊断和病情检测的临床需求，故亟待探索新型肿瘤标志物。

circRNA 作为一种稳定性高、半衰期长的明星分子，有望成为未来具有高度诊断价值的胃癌标志物。文献表明，血液circRNA的临床诊断价值高于经典血液肿瘤标志物，甚至优于同类组织circRNA。Sun 等[33]分析了circ_0000520在血液中的诊断价值。结果显示，其灵敏度、特异度、AUC为0.8967、0.8235、0.8444，显著高于CEA、CA19-9等标志物。Huang 等[34]报道血液circ_0000745 探测灵敏度达0.855，但特异度相对较差，这可能是由于circRNA在人体各组织内广泛表达，circRNA的高水平背景干扰了对于胃癌特异性circ_0000745的探测。构建circRNA 分子诊断组也是研究方向之一，Li 等[27]将组织和血液内的circ_0001017和circ_0061276 作为诊断组，灵敏度、特异度高达0.955和0.957，明显高于各自分子的诊断效能，有效弥补了单一circRNA的诊断劣势。

2.3 胃液circRNA

由于其时空特异性，胃液成分分析在理论上具有非常高的临床转化价值，但极端pH值的外环境致使大部分肿瘤标志物无法稳定存在，不具备充分探测条件。随着新式分子生物学技术的发展，circRNA 凭借独特的生物学性质在胃液诊断中崭露头角。慢性萎缩性胃炎是癌前病变之一，由于其症状和病理的不典型，是临床鉴别的难点。Shao 等[26]发现胃液circ_0014717在鉴别慢性萎缩性胃炎和胃溃疡、正常组织方面具有显著意义，这提示积极推进胃液circRNA的临床诊断转化有助于提高胃癌的早期诊断和预防干预。

3 circRNA与胃癌预后判断

胃癌患者预后判断是临床诊治的重要一环，对预测生存时间、规避过度医疗、缓解医患纠纷意义重大。临床采用的预后判断方式主要是病理分期和患者生存质量，无法实现精准预测。预后判断效果主要依靠生存分析（Kaplan-Meier 法）进行评价，并利用单因素和多因素分析法剖析某项因素对生存期的影响。新近研究证明，多种circRNA 可作为胃癌患者的独立预后因子，与患者生存时间具有密切联系，如circ_100269、circ_0001017和circ_0061276[27,35]。Zhang 等[36]报道circ_101057表达水平对早期胃癌患者的预后具有显著指示意义。高水平circ_101057的早期胃癌患者总生存期（overall survival，OS）更长，对奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的化疗更敏感，显示circRNA在胃癌患者生存预测和化疗方案指导方面有重要作用。Chen 等[37]发现联合检测circPVT1和PVT1 mRNA的表达可提升单一标志物的预测效能。与胃癌诊断相同，circRNA 分子也是未来预后判断的发展方向。但需要注意的是，盲目累加cir⁃cRNA 仅会提高临床医师的判断难度，增加医疗成本。如何挑选具有高判读价值的circRNA 并将其有机组合，也是转化过程中的难点之一。

4 circRNA与胃癌治疗

研究显示，circRNA 是胃癌发生发展和命运转归的重要调节者，干扰circRNA在胃癌细胞中的表达，可有效抑制和逆转各种恶性生物学行为，证明circRNA在胃癌治疗中同样具有出色的转化潜力。目前的研究集中于circRNA 作为“分子海绵”吸附下游miRNA调控胃癌的机制拓展。

circNRIP1在胃癌细胞内高表达，后续实验发现circNRIP1/miR-149-5p/AKT1/mTOR 通路在胃癌的生长和侵袭中具有重要作用。文献证明，AKT1/mTOR与胃癌细胞的上皮间质转化（epitheli⁃al-mesenchymal transition，EMT）、抗凋亡和多药耐药存在机制关联[38]。敲低circNRIP1 可以在体内、外水平抑制肿瘤的生长、增殖和转移，是良好的临床治疗靶点[39-40]。FOXO3 是叉头框转录因子家族的重要成员，在多种肿瘤中扮演着抑癌因子的角色[41]。Lu 等证明circ_0001368 可以互补吸附miR-6506e5p，解除miR-6506e5p 对FOXO3的抑制作用，遏制胃癌细胞的恶性增殖和转移能力[42]。除直接调控肿瘤细胞表型外，circRNA 也参与调控肿瘤性恶病质。 ciRS-133 通过miR-133/PRDM16 通路促进胃癌患者白色脂肪向棕色脂肪转化，提高患者代谢效率和氧耗量，最终导致恶病质。相反，敲低ciRS-133 可以有效降低小鼠胃癌模型的氧耗量和产热能力[43]。ciRS-133 抑制剂有望成为胃癌晚期患者治疗的辅助用药，延长患者生存期，改善生存质量。

表1 胃癌circRNA作为microRNA“分子海绵”的机制总结

Liu 等[44]创新了以人造小分子干扰方式调节circRNA表达水平的思路。大量研究证明，miR-21 是胃癌恶性进展的参与者之一[45-47]。该团队利用分子生物学手段构建了含有5个miR-21 吸附位点的人造circRNA（scRNA21）。具体方式如下：利用重叠PCR 扩增miR-21 互补结合位点，形成scRNA21的基本功能单位；扩增产物连接至含有T7 启动子的环状质粒；单酶切质粒，变为线性结构；利用T7 RNA 聚合酶大量扩增功能单位；磷酸酶去除5'端磷酸化；T4 多核苷酸激酶使RNA 分子具备稳定连接能力；T4 连接酶使线性RNA 成环。scRNA21 通过抑制miR-21 降低细胞增殖，诱导细胞凋亡，Western 印迹显示其下游抑癌蛋白DAXX表达上调，以上结果证明基于circRNA 结构的miR-21 抑制剂构建成功。人造circRNA 可以灵活调节miRNA抑制效率，精准性高，兼顾安全性和有效性，与RNA 干扰一同作为胃癌相关miRNA的干预方式，也是未来胃癌治疗的发展方向之一。

5 结语

circRNA 具有稳定性、特异性、保守性等优势，是近年基础和临床研究的明星分子之一，促进了胃癌早期诊断、病情监测、预后判断、个体化治疗的发展步伐。尤其是胃液circRNA的发现和人造circRNA的构建，极大地拓展了胃癌诊治的新思维。但是circRNA与胃癌的关系探索仍处于初级阶段，尚无法达到临床应用的基本要求。相信随着生物探测技术的逐步优化，胃癌发生发展和恶性转归的机制将逐渐阐明，circRNA 将成为胃癌临床诊治中的重要一环。