重组新城疫病毒疫苗研制现状

李文桂，陈雅棠

重庆医科大学附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆 400016

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称禽副粘病毒1 型（Avian paramyxovirus type 1，APMV-1），是禽类新城疫的病原体，对禽类养殖危害较大。按照其致病特性，NDV 常分为低毒、中毒和高度株，其中低毒株是传递目的基因的理想载体，可作为病毒载体表达外源基因。Peeters等[1-2]首先构建了NDV的反向遗传操作系统，这为构建重组新城疫病毒提供了有利工具。人们先后构建了多种表达绿色荧光蛋白（GFP）或增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组 NDV 疫苗[3-5]，这为筛选重组新城疫病毒提供了方便。国内外学者先后报道了大量重组新城疫病毒疫苗，这些病原体包括禽流感病毒、人副流感病毒3 型、犬瘟热病毒、禽巨肺病毒、呼吸道合胞病毒、Nipah 病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、牛短崭热病毒、传染性支气管炎病毒、重症急性呼吸综合征冠状病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、肠病毒71 型、脊灰病毒、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、传染性法氏囊病毒、诺如病毒、非洲猪瘟病毒、牛疱疹病毒1 型、西尼罗病毒、鹅细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体和博氏疏螺旋体等。在此，我们简要综述重组新城疫病毒的构建及其免疫机制等方面的研究进展。

1 重组新城疫病毒抗正粘病毒

1.1 禽流感病毒

禽流感病毒（Avian influence virus，AIV）的血清型多，变异性强，严重威胁养禽业，并可感染人类。AIV 可分为低致病（LPAIV）的 H9N2 型和高致病（HPAIV）的H5N1 和H7N9 型。血凝素（HA）是一种包膜糖蛋白，可诱导宿主产生细胞和体液免疫应答[6]。Nakaya 等[7]将 HA 基因插入 pNDV/B1得 pNDV-HA，加辅助质粒 pTM-NP、pTM-N 和pTM-L 共同导入新城疫病毒HB1 株，然后转染鸡胚成纤维细胞（CEF）的DF1 株，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合rNDV-HA表达的70kD的HA抗原。将 3×107PFU 疫苗静脉或腹腔注射BALB/c 鼠，初次接种后4 周进行加强，初次接种后5 周免疫组的血清IgG 上升，滴度分别为 1∶360 和 1∶110，此时用 105PFU的 A 型流感病毒WSN-33 株进行滴鼻攻击，攻击后10 d 发现静脉、腹腔注射组和对照组的保护力分别为100%（5/5)、100%（5/5）和0（0/5）。

Nagy 等[8]将 HA 基因插入 pNDV 得 pNDV-HA，加新城疫病毒LaSota 株转染人腺癌肺泡基底上皮细胞A549，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可识别 rNDV-HA 表达的63kD的HA抗原；将 107病灶形成单位（FFU）疫苗点眼滴鼻或肌肉注射接种2 周龄仔鸡，接种后4 周提示免疫组血清IgG 上升，此时用107PFU 禽流感病毒H9N2 株进行点眼滴鼻攻击，攻击后3～9 d 发现口咽和泄殖腔拭子的病毒负荷明显降低，肝、肺和支气管病变显著减轻。Hu 等[9]将HA 基因插入pLX 得pLX-HA，加新城疫病毒LaSota株共同转染BSR-T7/5 株，筛选重组病毒，以从rNDVHA 提取的总RNA 为模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1750 bp的基因片端；将5×106EID50（鸡胚半数感染量）疫苗滴鼻接种3 周龄仔鸡，初次接种后2 周进行加强，初次接种后4 周提示免疫组血清IgG 上升，此时用105EID50禽流感病毒H7N9 株进行滴鼻攻击，攻击后2 周免疫组和对照组的存活率分别为80%（8/10）和0（0/5）。曹有才等[10]将HA 基因插入pBSK得pBS-HA，与pBRN-FL 重组得pBRN-HA，加新城疫病毒LaSota 株共同转染BSR-7 细胞，筛选重组病毒，间接免疫荧光技术提示rNDV-HA的表面含有HA 抗原分子。胡潇等[11]将HA 基因插入pMD-18T得pMD-HA，与pTS-M 重组得pTS-HA，加新城疫病毒 LaSota 株转染 BHK-21 细胞，Western 印迹发现感染血清可识别rNDV-HA 表达的61 kD的HA 抗原。

人们发现将目的基因按照动物密码子的使用偏好进行优化，可明显提高靶基因在细胞中的表达水平，从而增强DNA 疫苗的免疫原性。陈曦等[12]将密码子优化的HA 序列（OptHA）插入pBSK得 pBSK-OptHA，与 pBRN-FL 重组得 pBRN-Op⁃tHA，加新城疫病毒LaSota 株共同转染BHK-21 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合 rNDV-OptHA 表达的 55 kD的 OptHA 抗原，共聚焦显微镜显示rNDV-OptHA 感染的细胞中存在HA 和NDV 抗原，其中表达的HA 蛋白定位于细胞膜上；将5×106EID50疫苗点眼滴鼻免疫1 周龄仔鸡，初次接种后5 周进行加强，提示免疫组的血清IgG 在初次接种后2～8 周上升，初次接种后7周上升到较高程度。

1.2 人副流感病毒3型

人副流感病毒3型（Human parainfluenza vi⁃rus type 3，HPIV3）是呼吸道感染的常见病原体。HN 蛋白位于病毒棘突的表面，具有血凝素和神经氨酸酶的活性，是一种保护性抗原[13]。Bukreyev等[14]将 HN 基因插入 pNDV 得 pNDV-HN，转化新城疫病毒BC 株后再转染人表皮样瘤癌细胞Hep-2，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合 rNDV-HN表达的65kD的HN抗原；将 106.5PFU疫苗滴鼻加支气管注射接种非洲绿猴，初次接种后后4 周进行加强，提示免疫组血清IgG 在初次接种后4～8 周上升，初次接种后8 周上升到较高程度，滴度可达1∶12.3。

2 重组新城疫病毒病毒抗副粘病毒

2.1 犬瘟热病毒

犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）是犬瘟热的病原体。H 基因编码的糖蛋白H 在病毒融合、生长和细胞嗜性方面具有重要作用，Cher⁃pillod 等[15]将pCI-H/F 肌肉注射免疫犬可有效对抗CDV的攻击,提示H/F 蛋白具有较好的免疫原性。田美杰等[16]以犬瘟热病毒的总RNA 为模板扩增 2330 bp的H基因，插入 pBSK 得 pBS-H，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合rNDV-H 表达的85kD的H蛋白；将2×109.5EID50疫苗肌肉注射接种犬，初次接种后3 周进行加强，提示免疫组血清IgG 在初次接种后2～5 周上升，初次接种后4 周上升到较高程度，滴度为1∶64。Ge 等[17]以犬瘟热病毒的总RNA 为模板扩增H 和F基因片段，分别插入pLaSota 得pLa-H/F，加辅助质粒转染Hep-2 细胞，筛选重组蛋白，以从rNDVH/F 抽提的总 RNA 为模板，采用 RT-PCR 方法可克隆出相应的H 基因和F 基因片段；将1×109EID50疫苗肌肉注射接种6 周龄水貂，初次接种后3 周进行加强，初次接种后5 周提示免疫组血清中和抗体上升，此时用2×104TCID50（半数组织培养感染剂量）犬瘟热病毒TM/JL2008 株进行滴鼻攻击，攻击后3 周rCDV-H、rCDV-F 和对照组的存活率分别为100%（4/4）、75%（3/4）和50%（2/4）。

2.2 禽巨肺病毒

禽巨肺病毒（Avian metapmeumovirus，AMPV）是火鸡鼻支气管炎的病原体之一。糖蛋白GP 和融合蛋白F 是2 种主要的膜系结构蛋白，具有较好的免疫原性[18]。Hu 等[19]以禽巨肺病毒的总RNA 为模板扩增G/F 基因，将G 基因插入pFLC-pLaSota 株得pLa-G，加辅助质粒转染DF1 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-F 抽提的总RNA 为模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1920 bp的G 基因片段；将107TCID50疫苗点眼滴鼻接种1 周龄火鸡，初次接种后2 周进行加强，初次接种后4 周提示免疫组血清 IgG 上升，此时用 4.2×1010TCID50禽巨肺病毒CoTr 株进行点眼滴鼻攻击，攻击后1 周取支气管拭子，荧光定量PCR 检查病毒负荷，发现免疫组和对照组的保护力分别为20%（2/10）和0（0/10）；随后将 F 基因插 入 pIRES-hrGFR2α 得pIRES-F，与 pLa-G 重组得 pLa-G/F，加辅助质粒转染DF1 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-G/F 抽提的总RNA 为模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1920 bp的 G 基因片段和 1700 bp的 F 基因片段；将107TCID50疫苗点眼滴鼻接种1 d 龄火鸡，接种后4 周提示免疫组血清IgG 上升，此时用1×103ID50（半数感染剂量）禽巨肺病毒AMPV-C 株进行点眼滴鼻攻击，攻击后1 周免疫组和对照组的保护力分别为80%（8/10）和0（0/10）。

2.3 呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）可引起小儿毛细支气管炎或支气管肺炎。融合蛋白F 是一种包膜蛋白，可引起RSV 与宿主细胞膜的融合，诱导宿主产生一定的保护力[20]。Martinez-Sobrido 等[21]将 F 基因插入 pLaSota 得 pLa-F，加辅助质粒转化Vero 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-F 提取的总RNA 为模板，采用RT-PCR方法可克隆出F 基因片段；将5×105PFU 疫苗滴鼻接种IFNAR-/-鼠，接种后4 周用107PFU 呼吸道合胞病毒有毒株进行鼻滴攻击，攻击后8 d 提示免疫组肺组织的病毒负荷下降至1/10，肺组织的病变减轻，ELISPOT 证实脾 IFN-γ+SFCs 数目增加。

2.4 Nipah病毒

Nipah 病毒（Nipah virus，NiV）可引起呼吸道感染，重症常伴有病毒性脑炎等并发症。糖蛋白G 和融合蛋白F 是Nipah 病毒包膜蛋白的主要成分，将它们免疫仔猪可产生有效的抵抗力[22]。Kong 等[23]将G/F 基因插入pLaSota 得pLa-G/F，加辅助质粒转化BHK-21 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-G/F 抽提的总RNA 为模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1920 bp的 G 基因片段和 1700 bp的 F 基因片段；将 2×109EID50疫苗肌肉注射接种仔猪，初次接种后4 周加强1 次，免疫组血清 IgG 在初次接种后 2～29 周上升，初次接种后13 周上升到较高程度。

3 重组新城疫病毒抗弹状病毒

3.1 水疱性口炎病毒

水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）是水疱性口炎的病原，将糖蛋白GP 免疫宿主可产生较好的免疫应答[24]。李晓芳等[25]以水疱性口炎病毒的基因组DNA 为模板扩增1592 bp的GP 基因，插入 pBSK 得 pBS-GP，与 pBRN-FL 重组得 pBRN-GP，加辅助质粒转染BHK-21 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合rNDV-GP 表达的60 kD的 GP 抗原；将 2×106EID50疫苗肌肉注射接种BALB/c 鼠，初次接种后3 周进行加强，提示免疫组血清IgG 在初次接种后2～5 周上升，初次接种后5 周上升到较高程度。Zhang 等[26]将107TCID50疫苗肌肉注射接种BALB/c 鼠，初次接种后3 周进行加强，初次接种后5 周提示免疫组血清IgG、IgG2a 和IgG1 上升；此时用107TCID50水疱性口炎病毒有毒株进行滴鼻攻击，攻击后5 d 免疫组的心脑肝肾组织病毒负荷下降至1/104；随后将107TCID50疫苗接种BALB/c鼠，雌雄共养2 周后产下仔鼠，用103TCID50水疱性口炎病毒EP 株对12 d 龄的仔鼠进行滴鼻攻击，攻击后12 d 免疫组和对照组的存活率分别为33%（3/9）和0（0/9）。

3.2 狂犬病毒

狂犬病毒（Rabies virus）是狂犬病的病原体，用狂犬病毒糖蛋白RGP 免疫动物可产生较好的抵抗力[27]。Ge 等[28]以狂犬病毒的总RNA 为模板扩增 RGP 基因，插入 pLaSota 得 pLa-RGP，加辅助质粒转染A549 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合rNDV-RGP 表达的RGP 抗原。将108.3、107.3和106.3EID50疫苗分别肌肉注射或滴鼻接种BALB/c 鼠，接种后3 周提示免疫组血清IgG 上升，此时肌肉注射50 MID50（半数小鼠感染剂量）狂犬病毒GX/09 株进行攻击，攻击后12 d 108.3免疫组、107.3免疫组、106.3免疫组和对照组的存活率分别为 100%（10/10）、100%（10/10）、60%（6/10）和 0（0/10）；随后将 109.8、109.3和 108.3EID50疫苗肌肉注射或滴鼻接种猫和犬，初次接种后3、6 周加强2 次，提示免疫组血清IgG 和中和抗体在初次接种后3～9 周上升，初次接种后60 周肌肉注射105.8MID50狂犬病毒GX/09 株进行攻击，攻击后12 周各免疫组的存活率均为100%（5/5），而对照组为20%（1/5）。

3.3 牛短崭热病毒

牛短崭热病毒（Bovine ephemeral fever virus，BEFV）是牛短崭热病的病原体之一。糖蛋白G 是一种包膜蛋白，可作为保护性抗原[29]。Zhang 等[30]以牛短崭热病毒的总RNA 为模板扩增G 基因，插入pLaSota 得pLa-G，加辅助质粒转化MDBK 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合 rNDV-G 表达的 80 kD的 G 抗原；将 2×107TCID50疫苗肌肉注射Holstein 小牛，初次接种后3周进行加强，初次接种后5 周提示免疫组血清中和抗体升高，滴度为1∶32。

4 重组新城疫病毒抗冠状病毒

4.1 传染性支气管炎病毒

传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis vi⁃rus，IBV）是鸡传染性支气管炎的主要病原体。纤突蛋白S 是位于病毒粒子表层囊膜上的糖蛋白，可诱导机体产生中和抗体[31]。S 蛋白可分解为S1和S2 亚单位，S1 亚单位高度易变，有助于病毒黏附于宿主细胞，含有主要的中和表位；S2 亚单位高度保守，有助于病毒的融合活性。焦利红等[32]以传染性支气管炎病毒M41 株DNA 为模板扩增S基因，插入 pBSK 得 pBS-S，与 pBRN-FL 重组得pBRN-S，加辅助质粒转染BSK 细胞，筛选重组病毒蛋白，以从rNDV-S 提取的总RNA 为模板，采用RT-PCR 方法可克隆出3534 bp的S 基因片段。Zhao 等[33]以传染性支气管炎病毒M41 株总RNA为模板扩增 S1 基因，插入 pNDV 得 pNDV-S1，加辅助质粒转染BSR-T7/5 细胞，筛选重组病毒，以从 rNDV-S 抽提的总 RNA 为模板，采用 RT-PCR 方法可克隆出S1 基因片段；将106EID50疫苗点眼滴鼻接种2 周龄仔鸡，初次接种后2 周进行加强，初次接种后3 周提示免疫组血清IgG 上升，流氏细胞仪（FACS）证实外周血单核细胞（PBMC）中CD4+和CD8+T 细胞数增加，此时用106EID50传染性支气管炎病毒有毒株进行点眼滴鼻攻击，攻击后2 周免疫组和对照组的存活率分别为100%（10/10）和0（0/10）。

4.2 重症急性呼吸综合征冠状病毒

重症急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）是重症急性呼吸综合征的病原体，棘突蛋白S 是一种结构蛋白，在病毒与宿主细胞的融合过程中起关键作用，将其接种宿主可产生中和抗体[34]。Dinapoli 等[35]将 107PFU 重组 NDV-S 疫 苗皮下注射非洲绿猴，初次接种后4 周进行加强，提示免疫组血清IgG 和中和抗体、支气管灌洗液和鼻咽拭子的SIgA 均在初次接种后28～56 d 上升，初次接种后42 d 上升到较高程度，初次接种后56 d 用106TCID50的SARS-CoV 进行滴鼻加气管内注射攻击，攻击后2 d 免疫组肺组织的病毒负荷下降至1/10 000，肺组织的病变减轻。

5 重组新城疫病毒抗丝状病毒

5.1 埃博拉病毒

埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）是人类重症出血热的病原体之一，用包膜糖蛋白GP 免疫宿主可产生较好的保护力[36]。Dinapoli 等[37]以埃博拉病毒的基因组DNA 为模板扩增GP 基因，插入pLaSota 得pLa-GP，加辅助质粒转染DF1 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合rNDV-GP 表达的100 kD的GP 抗原；将107PFU 疫苗滴鼻或支气管注射接种恒河猴，初次接种后4 周进行加强，提示免疫组血清IgG和中和抗体以及鼻、支气管分泌液的SIgA均在初次接种后4～8 周上升，初次接种后8 周上升到较高程度，FACS检测表明PBMC中IFN-γ+或TNF-α+的 CD8+T 细胞增加。

5.2 马尔堡病毒

马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）是马尔堡出血热的病原体。糖蛋白GP 是一种主要结构蛋白，具有较好的免疫原性[38]。胡旭东等[39]将2046 bp的 GP 基因插入 pBSK 得 pBS-GP，与 pBRN-FL重组得pBRN-GP，加辅助质粒转化BHK-21 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清结合rNDV-GP 表达的 40 kD的 GP 抗原；将 107EID50疫苗肌肉注射BALB/c 鼠，初次接种后3 周进行加强，初次接种后5 周提示免疫组血清IgG 上升。

6 重组新城疫病毒抗小RNA病毒

6.1 肠病毒71型

肠病毒71 型（Enterovirus type 71，EV71）可引起幼儿手足口病，常伴发中枢神经系统并发症。VP1 是一种核壳蛋白，将其接种动物可产生较好的抵抗力[40]。 Sivasamugham等[41]将VP11-100基因插入pTrcHis2-NPt 得pNPt-VP11-100，将其转化大肠杆菌 Top10，IPTG 诱导，Western 印迹发现感染血清可结合重组病毒表达的60 kD的NPt-VP11-100融合蛋白；将200 μg 重组蛋白加弗氏佐剂皮下注射接种新西兰大白兔，初次接种后4、6 周加强2 次，初次接种后10 周提示免疫组血清IgG 上升。Ch'ng等[42]将10 μg 重组蛋白加弗氏佐剂皮下注射接种BALB/c 鼠，初次接种后1 周进行加强，初次接种后2 周提示免疫组血清IgG 上升，此时腹腔注射10 LD50（半致死剂量）的肠病毒71 型P5 株进行攻击，攻击后5 d 免疫组和对照组的存活率分别为94.7%（18/19）和 40%（6/15），免疫组脑脊髓和骨骼肌的病理变化明显减轻。

6.2 脊灰病毒

脊灰病毒（Poliovirus）可引起小儿麻痹症。核壳蛋白的前体可被病毒蛋白酶3CD 分解为核壳蛋白P1，P1 和3CD 共表达后可形成病毒样颗粒（VLP），诱导宿主产生保护性抗体[43]。Viktorova等[44]以脊灰病毒的基因组DNA 为模板扩增P1/3CD 基因，将其插入 pLaSota 得 pLa-P1/3CD，加辅助质粒转化HeLa 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合rNDV-P1/3CD 表达的80 kD的 P1 蛋白和 70 kD的 3CD 蛋白；将 105PFU 疫苗滴鼻接种Hartley 豚鼠，初次接种后3 周进行加强，提示免疫组血清IgG、IgM 和中和抗体在初次接种后3～11 周上升，初次接种后9 周上升到较高程度，阴道分泌物IgG 和中和抗体在初次接种后3～9 周上升，初次接种后7 周上升到较高程度。

7 重组新城疫病毒抗其他病毒

7.1 Ⅰ型人类免疫缺陷病毒

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（Human immunodefi⁃ciency virus type 1，HIV-1）是获得性免疫缺陷综合征的病原体。gp160 和gp41 是2 种有效的疫苗候选抗原分子。Carnero 等[45]将密码子优化的Gag 序列（optGag）插入pSL1180 得pSL-optGag，加新城疫病毒HB1 株共同转染DF1 细胞株，筛选重组病毒，Western印迹发现感染血清可结合rNDV-optGag 表达的49 kD的 optGag 蛋白；将 5×105PFU 疫苗滴鼻接种 BALB/c 鼠，初次接种后3 周进行加强，初次接种后6 周提示脾IFN-γ+的CD8+T 细胞增加，此时用106PFU 表达Gag 蛋白的重组牛痘病毒（VV-Gag）进行滴鼻攻击，攻击后5 d发现肺组织的病毒负荷下降至1/100。Maamary 等[46]将 Gagp41 基因插入 pLaSota 得 pLa-Gagp41，加辅助质粒转染Vero 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合rNDV-Gagp41 表达的 70 kD的 Gagp41 抗原；将 5×105PFU 疫苗滴鼻接种C×B6F1 鼠，初次接种后4 周进行加强，初次接种后5 周经ELISPOT 证实脾IFN-γ+、IL-2+、TNF-α+的CD4+或CD8+T 细胞数增加，初次接种后8 周提示免疫组血清IgG上升，此时用106PFU重组VV-Gag进行滴鼻攻击，攻击后6 d 免疫组肺组织的病毒负荷下降至1/106。

Khattar 等[47]将 gp160 基因插入 pCR2-1 得 pCR2-1-gp160，与pLaSota 重组得pLa-gp160，加辅助质粒转染DF1 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-gp160 抽提的总RNA 为模板，采用RT-PCR 方法可克隆出2598 bp的 gp160 基因片段；将 106PFU 疫苗滴鼻或肌肉注射豚鼠，初次接种后2、4 周加强2 次，初次接种后 6 周提示免疫组血清 IgG、IgGa 和 IgG1 上升，阴道分泌物SIgA 升高，血清中和抗体的滴度分别为1∶164 和1∶44；随后又构建了rNDV-Gag/env，Western印迹发现感染血清可结合rNDV-Gag/env 表达的120 kD的 Gp160 蛋白和 55 kD的 p55 蛋白；将 105PFU 疫苗滴鼻接种豚鼠，初次接种后3 周进行加强，发现免疫组血清IgG 在初次接种后3～8 周上升，初次接种后7 周上升到较高程度，阴道分泌物SIgA 在初次接种后3～8 周上升，初次接种后6 周上升到较高程度，初次接种后 4 周经 ELISPOT 证实脾 IFN-γ+SFC 数增加，初次接种后9 周用107.2TCID50重组VV-Gag 进行滴鼻攻击，攻击后5 d 免疫组的肺组织病毒负荷下降至1/1000。

7.2 传染性法氏囊病毒

传染性法氏囊病毒（Infectious bursal diseasevirus，IBDV）是禽类法氏囊病的病原体。VP2 是一种构成病毒粒子的结构蛋白，将其接种动物可产生保护性抗体[48]。Huang 等[49]以传染性法氏囊病毒GLS-5 株总RNA 为模板扩增VP2 基因，插入pGEM-TZ(+)得 pGEM-VP2，与pLaSota重组得pLa-VP2，加辅助质粒转染DF1 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-VP2 抽提的总RNA 为模板,采用RT-PCR 方法可克隆出1359 bp的VP2 基因片段；将1×104ELD50疫苗点眼接种1 d 龄仔鸡，初次接种后3 周加强1 次，初次接种后6 周提示免疫组血清 IgG 和中和抗体上升，滴度分别为 1∶7120 和 1∶982，此时用103EID50传染性法氏囊病毒GLS-5 株进行点眼攻击，攻击后3 d 免疫组和对照组的存活率分别为100%（10/10）和0（0/10）。

Ge 等[50]将VP2基因插入pBRN-FL得pBRNVP2，加辅助质粒转染BHK-21 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可识别rNDV-VP2表达的 42 kD的 VP2 抗原；将 2×106EID50疫苗点眼滴鼻接种7 d 龄仔鸡，接种后3 周用105EID50传染性法氏囊病毒GX 株进行点眼滴鼻攻击，攻击后8 d 免疫组和对照组的存活率分别为100%（12/12）和 0（0/8）；随后将 105.5、104.5、103.5和 102.5EID50疫苗分别卵内注射接种18 d 龄鸡胚，注射后22 d 仔鸡孵出，此时用103EID50传染性法氏囊病毒GX 株进行点眼滴鼻攻击，攻击后10 d 各免疫组和对照组的存活率分别为74%（37/50）、82%（41/50）、80%（40/50）、86%（43/50）和14%（7/50）。

7.3 诺如病毒

诺如病毒（Norovirus，NoV）可引起病毒性胃肠炎，OPF2 编码的VP1 是一种主要核壳蛋白，该蛋白可自身聚合成病毒样颗粒，将其接种动物可产生有效的抵抗力[51]。Kim 等[52]以诺如病毒VA387株的总RNA 为模板扩增1644 bp的VP1 基因，插入pLaSota 得 pLa-VP1，加辅助质粒转染DF1 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合 rNDV-VP1 表达的 58 kD的 VP1 蛋白；将 106EID50疫苗滴鼻接种 BALB/c 鼠，初次接种后 2、4 周加强2 次，初次接种后6 周提示免疫组血清IgG 和IgG2a 上升，粪 SIgA 升高，ELISPOT 发现脾 IFN-γ+或TNF-α+SFC 数增加。

7.4 非洲猪瘟病毒

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）可引起非洲猪瘟。P30 和P72 是2 种有效的保护性抗原，具有较强的免疫原性[53]。Chen 等[54]以非洲猪瘟病毒 E70 株的 DNA 为模板，扩增 p30 和 p72 基因，插入pBSK得pBS-p30/p72，与pLaSota重组得pLa-p30/p72，加辅助质粒转染BHK-21 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-p30/p72 抽提的总RNA 为模板，采用RTPCR 方法可克隆出 600 bp的 P30 基因片段，Western印迹发现感染血清可结合rNDV-p30/p72 表达的30 kD的 P30 蛋白和 72 kD的 P72 蛋白；将 108EID50重组NDV-p30 肌肉注射BALB/c 鼠，初次接种后2、4 周加强2 次，初次接种后5 周提示免疫组血清IgG上升；接着将108EID50重组NDV-p72 肌肉注射BALB/c 鼠，初次接种后 2、4、6 周加强 3 次，初次接种后 8 周提示免疫组血清IgG、IgG1 和IgG2a 上升，脾细胞明显增殖，ELISPOT证实脾IFN-γ+或IL-4+SFC显著增加。

7.5 牛疱疹病毒1型

牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvirus type 1，BHV-1）是牛传染性鼻支气管炎的病原体。糖蛋白gD 是一种包膜蛋白，参与病毒黏附并进入宿主细胞，可诱导有效的保护力[55]。Khattar 等[56]以牛疱疹病毒1型的基因组DNA 为模板扩增gD 基因，插入pCR2-1得pCR2-1-gD，与pLaSota 重组得pLa-gD，加辅助质粒转化MDBK 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可识别rNDV-gD 表达的71 kD的gD 单体蛋白和140 kD的gD 二聚体蛋白；将106PFU 疫苗滴鼻接种12 周龄小牛，提示免疫组血清IgG 和鼻咽拭子SIgA 在接种后1～4 周上升，接种后 2 周上升到较高程度，接种后 4 周用2×107PFU 牛疱疹病毒 1 型Cooper 株进行滴鼻攻击，攻击后10 d 免疫组的鼻咽拭子病毒负荷下降至1/1000。

7.6 西尼罗病毒

西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）可引起西尼罗热，前膜蛋白prM 和包膜蛋白E 是病毒表面的糖蛋白，可在病毒表面形成异二聚体，将其接种动物可产生较好的抵抗力[57]。Wang 等[58]人工合成 prM/E 基因，插入 pLaSota 得 pLa-prM/E，加辅助质粒转化BHK-21 细胞，筛选重组病毒，Western印迹发现感染血清可结合rNDV-prM/E表达的25 kD的prM蛋白和45kD的E蛋白；将 2×109EID50疫苗肌肉注射接种儿马，初次接种后3 周进行加强，初次接种后5 周提示免疫组血清IgG 和中和抗体上升；随后将2×108EID50疫苗肌肉注射或1×1010EID50疫苗口服接种4 周龄仔鸡或幼鹅，初次接种后3 周进行加强，初次接种后5 周提示免疫组血清IgG 和中和抗体显著上升。

7.7 鹅细小病毒

鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）可引起幼鹅瘟，将核壳蛋白VP3 接种幼鹅可产生保护性抗体[59]。Wang 等[60]以鹅细小病毒 GD01 株为模板扩增 VP3 基因，插入 pCI-MNA-1 得 pCI-VP3，将其导入新城疫病毒pLaSota 株后再转染BHK-21 细胞，筛选重组病毒，Western 印迹发现感染血清可结合rNDV-VP3 表达的 70 kD的 VP3。将 106EID50疫苗皮下注射4 d 龄幼鹅，初次接种后2 周进行加强，提示免疫组血清中和抗体在初次接种后3～12 周上升，初次接种后6 周上升到较高程度。

7.8 猪圆环病毒Ⅱ型

猪圆环病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type 2，PCV2）可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，ORF2编码的衣壳蛋白Cap 可自身聚合为病毒样颗粒，将其接种仔猪可产生有效的抵抗力[61]。Cap△41 是删除NLS 序列的Cap 基因，王子龙等[62]以猪圆环病毒Ⅱ型 G 株为模板，扩增 Cap/Cap△41 基因，插入pBRN-FL 得 pBRN-Cap/Cap△41，加辅助质粒转染BHK-21 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-Cap/Cap△41 提取的 DNA 为模板，采用 PCR 可克隆出 750 bp的 Cap 基因片段和 600 bp的 Cap△41 基因片段，共聚焦显微镜显示rNDV-Cap/Cap△41 感染的细胞中存在 NDV 蛋白及 PCV2的 Cap、Cap△41 蛋白，其中Cap 蛋白位于胞核，而Cap△41 位于胞浆中。

7.9 传染性喉气管炎病毒

传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）可引起传染性喉气管炎，糖蛋白gB 与病毒吸附和进入细胞有关，是一种保护性抗原分子[63]。孙娜娜等[64]以传染性喉气管炎病毒LJS09 株的DNA为模板扩增gB 基因，插入pBR-FL 得pBR-gB，加辅助质粒转染BSR-T7/5 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-gB 抽提的总 RNA 为模板，采用 RT-PCR 方法可克隆出1323 bp的gB 基因片段，Western 印迹发现感染血清可结合rNDV-gB 表达的gB 抗原。

8 重组新城疫病毒抗细菌

8.1 鸡毒支原体

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）可引起鸡呼吸道感染。TM1 基因编码一种29 kD的蛋白，将其免疫仔鸡可诱导一定的保护力[65]。冯秋霞等[66]以鸡毒支原体的基因组DNA 为模板扩增 TM1 基因，插入 pBRN-FL 得 pBRN-TM1，加辅助质粒转染BHK-21 细胞，筛选重组病毒，以从rNDV-TM1 提取的总RNA 为模板，采用PT-PCR方法可克隆出1960 bp的TM1 基因片段；将106ELD50疫苗点眼滴鼻接种6 d 龄仔鸡，提示免疫组血清IgG 在接种后1～3 周上升，接种后3 周上升到较高程度；在接种后3 周用5×108CFU 鸡毒支原体有毒株进行气管内注射攻击，攻击后2 周免疫组和对照组的保护力分别为90%（9/10）和0（0/10）。

8.2 博氏疏螺旋体

博氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）可引起莱姆病。基础膜蛋白BmpA 是一种外膜蛋白，与莱姆病的关节炎发生密切相关[67]。Xiao 等[68]以博氏疏螺旋体的基因组DNA 为模板扩增BmpA 基因，与组织纤溶酶原激活物（tpA）基因融合后，插入pLaSota 得pLa-tpA-BmpA，加辅助质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3，筛选重组病毒，Western印迹发现感染血清可结合rNDV-tpA-BmpA 表达的 42 kD的 BmpA 蛋白；将 106PFU 疫苗滴鼻接种仓鼠，初次接种后2 周进行加强，初次接种后3 周提示免疫组血清IgG 上升，此时腹腔注射108CFU班氏疏螺旋体进行攻击，攻击后12 d 取关节、心和膀胱组织，荧光定量PCR 检查细菌负荷，发现免疫组的关节细菌负荷明显减少，膀胱细菌负荷轻微降低，心脏细菌负荷则无明显变化。

9 结语

新城疫病毒的基因组结构和功能已研究得比较清楚，血清型仅有1 个，遗传性状比较稳定，毒株重组和毒力返强的机会微乎其微，而且其复制过程仅在胞质中完成，没有DNA 阶段，肯定不能与宿主细胞的DNA 发生结合；新城疫病毒能容纳附加的RNA 节段，可作为载体向细胞内运输靶抗原，可能得到免疫预防的理想效果；新城疫病毒仅编码8 种内在蛋白，明显减少了内在蛋白与目的蛋白竞争免疫显性表位的可能性；新城疫病毒的基因组可以插入大于4 kb的外源基因，能够稳定表达，可诱导宿主产生体液免疫、局部黏膜免疫及细胞免疫；新城疫病毒仅感染禽类，人体不会存在抗NDV的抗体；重组新城疫病毒可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种途径接种，方便高效，简单易行；重组新城疫病毒对呼吸道具有亲嗜性，插入的目的基因通常不改变新城疫病毒的复制、致病性和嗜向性；重组新城疫病毒对基因交换具有抵抗性，可在常规实验室进行操作；重组新城疫病毒在细胞或鸡胚经过多次传代仍可高效稳定表达外源基因，而且具有高效价的鸡胚生长特性，生产成本较低；新城疫病毒的基因组仅有1 个启动子，基因间隔序列可降低其转录水平，所以插入位点的选择对于重组病毒的复制以及外源基因的表达十分关键；新城疫病毒的基因组含有6 个转录单位NP、P、M、F、HN、L，目的基因插入位点愈靠近3'端，表达水平愈高。

分子生物学技术的发展，必将推动病毒或细菌的基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学以及表观遗传学的研究进展，这对于阐明病毒或细菌蛋白的抗原结构与功能的关系，筛选新的抗原分子，构建由各期抗原分子组成的多期多价疫苗具有重要指导意义，有必要研究这些疫苗的免疫原性、转化效率、MHC 限制性以及能否长期在宿主体内表达。在重组新城疫病毒的构建过程中，要深入了解各个启动子的特性，启动子与终止子的调控关系，分析外源基因的特点，完善重组病毒的构建平台，提高外源基因的表达量，增强免疫原性的稳定性；研制新型佐剂、疫苗载体和制备融合抗原，提高疫苗的免疫原性；积极探索重组新城疫病毒的免疫剂量、免疫次数、免疫间隔时间和免疫途径等。期待这些焦点的阐明将重组新城疫病毒疫苗的研究带入一个新时代。