慢性伤口细菌生物膜临床和实验诊断的研究进展

魏 敏，牛 妞，蒋琪霞

慢性伤口是指经过6周临床治疗后，仍无法及时有效地按正常程序愈合的伤口，主要包括压疮、糖尿病足溃疡、创伤性溃疡及下肢动静脉溃疡，此类伤口病程迁延[1-2]。研究证实细菌生物膜是影响慢性伤口持久不愈的重要原因[2]。如何快速准确识别生物膜及其病原菌是临床有效干预的前提。笔者就慢性伤口生物膜的概念及分布、临床识别方法、临床诊断标准、常用实验室诊断方法作如下综述。

1 生物膜的概念及分布

生物膜是细菌为适应生存环境的变化而群居并吸附于伤口表面，产生富含多糖、蛋白质、DNA、脂类和水等物质的细胞外基质(extracellular polymeric substances,EPS)，并形成具有立体结构的膜样复合物[3]。伤口细菌形成的生物膜将菌体层层包裹，阻止或延缓抗生素渗透而难以发挥抗菌作用并诱导细菌对抗生素产生耐药性[4]，导致伤口难以愈合。

近年来已证实慢性伤口中普遍存在生物膜，且发生率逐年增加。早在2008年James等[5]发现60%的慢性伤口存在生物膜感染，近期研究显示其在慢性伤口中发生率已达到75%～90%[3,6]，给治疗带来极大挑战。然而，近年一系列体内实验发现急性伤口中生物膜感染也有增多趋势。有研究发现在5例足溃疡的急性伤口中均存在生物膜[7]，而对比往期研究[6]急性伤口生物膜感染发生率仅为6%。Gurjala等[8]通过兔耳急性伤口模型发现金黄色葡萄球菌在接种后24h内形成生物膜，Tongtong等[9]研究显示同样在兔耳急性感染伤口中，金黄色葡萄球菌接种6h即迅速成长并建立成熟生物膜。以上研究均表明，伤口在细菌感染后24h内即可完成生物膜自我繁殖过程，推测未来生物膜在急性伤口中的发生率也将增加。目前关于生物膜的识别仍没有统一定论，临床识别更加困难。如何早期识别诊断继而实施针对清除生物膜的伤口管理策略，最终改善患者伤口预后尤为重要。

2 生物膜的临床识别

2.1生物膜的临床特点 经大量临床及实验研究证实，生物膜的临床特点可总结为以下四点：(1)肉眼观察生物膜呈薄层淡黄色半透明的胶状物质[7]。由于某些细菌增殖可导致色素分泌，其外观颜色也会相应改变，如临床中最常见且最易形成生物膜的两种细菌-金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌，可分别产生葡萄球菌黄素和绿脓菌素，致使生物膜呈淡黄色和淡绿色[10-12]。这一特点是有效进行临床识别的第一步。(2)生物膜可存在于伤口表面及较深组织中。研究显示生物膜不仅覆盖在伤口表面，还常常隐藏于基底组织中(平均深度为50～70微米)[7]，且不同种类细菌生物膜定植的深度不同，如厌氧菌的深度显著大于需氧菌。定植于伤口深部这一特点可能是导致伤口处于持续炎症过程的重要因素[13]，给临床肉眼识别带来难度。(3)去除容易，但易快速重新形成。这是慢性伤口生物膜特异性的临床特点。伤口表面的生物膜可通过诸如镊子、保守性锐器等机械清创方法轻易去除，显示出基底部新鲜的肉芽组织，但清创后，残留在伤口中的游离细菌能够在24h内迅速重建生物膜[10]，以逃避宿主反应和抗菌剂的作用。而重新形成的生物膜对抗菌剂的耐药性增强，更加难以清除[7]。因此，清创后应结合抗菌及抗生物膜敷料等有效处理，最大限度地减少残留细菌重新形成生物膜的机会。 (4)与腐肉相鉴别。腐肉常常与生物膜同时覆盖在伤口表面，可成为生物膜中细菌生长繁殖的培养基，临床中易混淆[13]。两者的临床鉴别要点可归纳为三点[9-10，13]：①两者性状不同。腐肉常呈黄色松散状，生物膜呈淡黄色半透明胶状。②由于腐肉与其下面的伤口基底部组织紧密连接，不易经机械清创去除，需锐器才能彻底去除。而生物膜可经机械方法清除。③腐肉对酶类或自溶清创类敷料较生物膜敏感，效果更佳。了解生物膜的临床特点及其鉴别诊断，有助于伤口专业人员快速有效临床判断生物膜的存在，及时给予相应干预措施，以免延误最佳治疗时机。

2.2生物膜的临床诊断标准 目前，已有专家提出生物膜的临床诊断标准。2012年世界生物膜研讨会初步总结了生物膜感染伤口的临床诊断标准[14]：(1)苍白水肿的伤口床；(2)脆弱的肉芽组织；(3)大量黄色渗液；(4)坏死腐烂组织；(5)伤口疼痛；(6)有腐臭味。2017年这一标准得以更新，生物膜感染共识指南[15]提出，伤口出现以下指征可能存在生物膜：(1)抗生素、抗菌剂治疗无效；(2)伤口愈合延迟；(3)反复感染或恶化；(4)大量渗液；(5)轻度慢性炎症；(6)轻度红肿。由此得出，两个标准中大量渗液是共有特征，是临床识别的重要标志。此外，Johani等[7]在65例糖尿病足溃疡伤口的生物膜临床研究中，通过与实验室诊断结果进行对比，证实了大量渗液是作为生物膜临床识别的重要依据。依据临床判断标准，结合生物膜的临床特点，伤口专业人员可初步判断伤口中的生物膜，但为了确认判断标准中每一条的科学性，未来应基于随机对照试验等高质量研究进一步加以验证。

3 生物膜的实验室方法

由于生物膜引起的感染较为隐匿，无急性感染的典型表现(红、肿、热、痛)[16]，且可能位于伤口深层组织中，临床难以用肉眼精确识别。进一步诊断还需借助实验室工具，通过确认生物膜中的细菌或细胞外基质中的特异性成分准确识别生物膜。

3.1识别生物膜中细菌 细菌培养技术被认为是临床上常用的识别致病菌的方法。传统取样方法为Z形拭子技术，即用生理盐水将棉签拭子打湿，旋转并以“Z形”锯齿状从伤口一边到另一边进行擦拭取样[17]。研究显示由于细菌定植部位的隐蔽性，大量厌氧菌隐藏在伤口深部，此种拭子技术不能充分触及伤口基底，因此常常低估慢性伤口中厌氧菌的存在[18]。

Copeland-Halperin等[19]证实，与Z技术相比，通过Levine技术诊断慢性伤口感染的准确性、灵敏度及特异性更高。具体方法为：将无菌棉签在伤口床的1cm2区域内旋转5s，同时施加轻微的压力，挤出伤口基底部的渗液，收集定植在深部的致病菌。Haalboom等[20]临床试验发现，在180名患者伤口中使用Levine技术进行伤口细菌取样的培养结果与金标准-活组织检查的结果类似，结果一致性达到84.4%～99.4%。

与活组织检查相比，拭子技术无侵入性、不增加患者痛苦、操作简单的特点更易被患者及医务人员接受，Levine技术值得临床推荐使用。为进一步提高生物膜感染伤口内细菌检出的准确性，近年发展出一些新的检测手段，如聚合酶链反应(PCR)、肽核酸荧光原位杂交技术(PNA-FISH)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、16S脱氧核糖核苷酸测序技术(16S rRNA)[16,21]等分子生物技术。但由于其操作复杂，价格昂贵，难以在临床广泛推广。

3.2识别生物膜中细胞外基质 识别生物膜的实验室方法包括扫描电子显微镜、激光共聚焦显微镜、聚合酶链反应与荧光原位杂交等，其中前两种最为常用。欧洲临床微生物学生物膜研究组指出，使用扫描电镜和激光共聚焦显微镜能提高生物膜实验诊断的阳性率[22]。

3.2.1扫描电子显微镜 扫描电子显微镜(简称"扫描电镜")可在样品表面扫描激发出电子而成像, 图像有很强的立体感, 可用来观察生物膜的形态结构。电镜下观察慢性伤口生物膜的典型结构为柱状或蘑菇状[23]，这些结构特征有利于细菌在生物膜内不断重复粘附、繁殖、成熟、脱落和播散感染的自我繁殖过程，不受外界干扰，且抗生素和抗菌剂难以渗透发挥作用[24]。

张洪辉[25]通过扫描电镜观察体外生物膜模型发现随着时间延长，细菌数量增多，生物膜增厚，结构逐渐稳定。培养5d后，菌体表面覆盖胞外多糖-蛋白质复合物(EPS)，互相凝集紧密包裹，形成成熟的生物膜；在体内实验中观察兔耳伤口上铜绿假单胞菌生物膜发现细菌细胞形成团片状，隆起于皮肤表面，包裹于胞外多糖-蛋白复合物(EPS)之间，趋于成熟。Johani等[7]通过电镜在58例糖尿病足溃疡慢性伤口标本中观察到 56例存在生物膜结构，显示球菌菌落被包裹在不同厚度的细胞外基质(EPS)中，未被包裹部分可见菌体的清晰形态。扫描电镜虽然可用来观察生物膜的大致结构，但对其内部成分无法识别，因此特异性较差，并且在脱水过程中可能会破坏生物膜本身的结构而影响观察，实验周期较长，不利于保证识别后进行临床干预的时效性。

3.2.2激光共聚焦显微镜 激光共聚焦显微镜(简称“共聚焦显微镜”)弥补了扫描电镜无法特异性识别的缺点，被认为是目前识别生物膜较为理想的方法。该方法可使用染色剂对生物膜中各种成分如多糖、DNA、蛋白质进行不同颜色的荧光染色，或使用凝集素特异性结合其中成分，通过共聚焦显微镜进行平面观察或连续断层扫描，发出特定颜色进行识别[24]。利用所得生物膜的平面图片可重建3D图像，通过图像软件对生物膜的各种指标如厚度、比表面积、各种荧光的强度等参数进行量化，比较细菌形成生物膜的动态过程中的各种量化数据[9，26]，进一步探索不同干预方法对清除生物膜的效果以指导临床实践。

有研究[25]使用Alexa Fluor 647荧光染料标记生物膜细胞外基质中蛋白质成分，染色后发出蓝色荧光；SYTO9 PI标记活菌，染色后发出绿色荧光，经共聚焦显微镜观察可见活菌细胞与胞外蛋白紧密包裹，呈棉絮状或集云状；经三维重建图形发现生物膜厚度增加，细菌聚集紧密，代谢减慢, 生物膜结构中通道和间隙的孔径和数目减少，逐渐达到相对稳定成熟的状态。Yu等[27]采用凝集素-刀豆蛋白A与铜绿假单胞菌生物膜中胞外多糖特异性结合；SYTO45标记细菌，观察生物膜形成过程中多糖及细菌分布情况，并且此种方法在操作过程中大大降低生物膜的减少与缺损程度。

4 小结

细菌生物膜所致的慢性伤口感染已成为伤口管理关注的焦点，通过其临床特点及最新判断标准初步识别及实验室方法准确诊断对于明确生物膜感染及制定相应治疗策略至关重要。目前关于伤口生物膜的研究以体外及动物模型为主，临床研究虽有增多趋势，但数量仍较少，文献中慢性伤口类型单一，未来需进一步在临床实验中深入研究。

预计未来的研究重点可能包括：(1)由于临床识别的主观性，实验诊断的复杂性，能否发明一些简易便携式的实时监测生物膜设备，这将更具有临床使用前景；(2)建立伤口细菌培养、生物膜电镜观察、共聚焦显微镜荧光染色标本采集及预处理的标准化流程以规范及统一操作方法，提高检测结果的准确性；(3)增加生物膜感染的临床研究，通过临床与实验室识别工具相结合的方法探究不同干预方法对清除生物膜的效果比较以指导临床实践。