慢病毒介导B7-2基因RNA干扰对小鼠树突状细胞诱导T细胞增殖的影响①

孔 永 颜天铭 王玉玉 沈立军 王 婧 邱玉华

(苏州大学医学部免疫学系，苏州 215123)

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由21～23 bp双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导的转录后基因沉默机制[1]，采用RNAi技术可特异性抑制树突状细胞(Dendritic cell,DC)表面共刺激分子表达，使其维持未成熟状态和致免疫耐受性能，对于诱导机体免疫耐受、治疗移植排异及自身免疫性疾病等具有重要的意义[2]。

DC是机体内功能最强和唯一能直接激活初始T细胞的专职性抗原递呈细胞(Antigen presenting cell,APC)，其在免疫应答/调节过程中发挥着重要作用[3，4]。在正常生理情况下，机体内多为未成熟DC(immature DC,iDC)，其表面中度表达MHCⅡ、不或低度表达B7-1/B7-2等共刺激分子，因其无法有效提供共刺激信号而不能激活T细胞，从而导致其凋亡、无能以及促进机体免疫耐受的产生[5]。在病理状态下，机体内炎性环境及抗原刺激DC发育成熟(mature DC,mDC)，导致T细胞活化增殖与免疫应答，从而促进疾病的发展[6]。

鉴此，本文构建慢病毒载体及介导小鼠B7-2基因RNAi，并研究其对DC表面B7-2的干扰效应以及对DC免疫性能的影响，为后续制备耐受性DC及应用于自身免疫性疾病模型的免疫干预研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 293T细胞(ATCC)；6～8周龄C57BL/6小鼠(苏州大学实验动物中心)；慢病毒载体系统(上海吉玛制药)；氨苄青霉素(Solarbio)；FBS及RPMI1640培养基(Gibco)；Lipofectamine2000 (Invitrogen)；限制性内切酶及T4 DNA连接酶(TaKaRa)；PE标记抗小鼠CD11c、MHCⅡ、B7-1及B7-2抗体(Biolegend)；Polybrene、MTT、LPS及DMSO(Sigma)；瑞氏染色试剂盒(碧云天生物)；重组小鼠GM-CSF及IL-4(Proptech)；尼龙毛柱(Polysciences)。

1.2方法

1.2.1序列选择与双发夹RNA模板设计 从GenBank鼠B7-2基因(NM_019388)的编码区中选择3段RNA干扰的靶序列：①长度为21个核苷酸；②GC含量30%～50%，不含连续的4个及以上T；③避免选择起始密码子下游和终止密码子上游100个核苷酸区域序列；④将靶序列在数据库中进行比较，确保与其他基因无同源性；⑤选择与小鼠B7-2无同源性序列作为检验RNAi特异性的阴性对照。双发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)模板由靶序列正向序列和反向互补序列通过环序列(TTCAAGAGA)相连接，并以6个T作为转录终止信号，同时在序列两端分别添加BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位点。所设计DNA寡核苷酸序列由上海吉玛公司合成。

1.2.2慢病毒表达载体的构建 将合成的DNA寡核苷酸序列进行退火形成shRNA前体DNA链。慢病毒表达载体经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切线性化后在T4 DNA连接酶作用下与模板双链DNA进行连接，随后连接产物转化感受态DH5α菌并置于氨苄LB培养基中进行克隆培养，每靶点随机挑取20个阳性克隆送Genescript公司进行DNA测序鉴定。

1.2.3重组慢病毒的制备与滴度测定 293T细胞接种于10 cm培养皿，待其处于对数期及60%～70%汇合时，重组慢病毒表达质粒及包装辅助质粒在Lipofectamine2000介导下共转染细胞12 h，更换含10%FBS的RPMI1640培养基继续培养。收集48 h及72 h的培养上清，于4℃及50 000 g超高速离心2 h进行浓缩。浓缩慢病毒经10倍梯度稀释感染293T后继续培养72 h，计数GFP阳性细胞数目并计算病毒滴度：病毒滴度(TU/ml)=(计数孔GFP+细胞数/感染病毒体积)×稀释倍数。

1.2.4小鼠骨髓源DC的培养与鉴定 无菌分离C57BL/6小鼠胫、股骨，冲洗骨腔获得骨髓，以200目筛网制备细胞悬液，随后采用红细胞裂解液处理及培养液洗涤获得小鼠骨髓细胞悬液。调整细胞浓度至1×106ml-1，2 ml/孔接种于24孔板中并添加GM-CSF(20 ng/ml)及IL-4 (10 ng/ml)，培养48 h后轻轻晃动培养板，吸弃悬浮细胞，更换新鲜培养基(含GM-CSF及IL-4)继续培养。隔日更换培养基，第6天换液时添加LPS(1 μg/ml)进行成熟刺激，第8天收获细胞。期间显微镜下监控细胞生长状态；收集第8天细胞流式分析其表面CD11c、MHCⅡ、B7-1及B7-2的表达情况。

1.2.5重组慢病毒对DC感染效率的测定 参照1.2.4操作分离培养DC并于第6天时在Polybrene(5 ng/ml)辅助下慢病毒(LV-NC)以不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)(0、5、10、20、40、60)进行感染12 h，随后换液继续培养60 h，荧光显微镜下观察GFP表达情况并流式测定感染效率。

1.2.6重组B7-2基因RNAi慢病毒感染对DC表面B7-2表达的沉默效果及有效B7-2基因RNAi慢病毒的筛选 根据感染效率测定结果优化感染条件后，3靶点RNAi慢病毒感染DC后继续培养72 h，流式分析其对细胞表面B7-2的沉默状况以及确定具有最佳干扰效果的小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒。

1.2.7重组B7-2基因RNAi慢病毒感染及沉默DC表面B7-2表达对DC免疫性能的影响 在96孔板中每孔接种2×104个慢病毒感染DC作为刺激细胞及2×105个尼龙毛柱吸附纯化的小鼠脾脏T细胞作为反应细胞共培养72 h，培养结束前4 h时每孔加入终浓度0.5 mg/ml的MTT溶液，结束培养时弃除培养基并加入150 μl/孔 DMSO溶解结晶物并测定A490值。

2 结果

2.1重组慢病毒表达载体的构建 在小鼠B7-2基因编码区选择了3段RNAi靶序列，根据首个碱基的位置分别命名为139、425、848。随后设计合成shRNA模板DNA序列并克隆至慢病毒表达载体，经测序鉴定重组载体中插入序列结构及组成符合设计要求(图1)。

2.2重组慢病毒的制备与滴度测定 重组慢病毒表达载体质粒与包装辅助质粒在脂质体介导下共转染293T细胞，培养24 h及48 h后可见GFP大量表达及重组病毒的成功包装(图2)，收获48 h及72 h的培养上清并进行超高速离心，病毒液得到浓缩，浓缩病毒液经梯度稀释感染293T细胞及检测转基因GFP的表达情况确定其滴度为(2～4)×108TU/ml(图3)。

2.3小鼠骨髓源DC的培养与鉴定 小鼠骨髓细胞接种于培养板后，光镜下可见大小不一的细胞(图4A)；第2天可见少量粒细胞集落形成(图4B)；第3天集落继续增多(图4C)，此时轻轻晃动培养板，倾去培养基以及悬浮细胞继续培养；第4天时可见具有伸展突起的巨噬细胞和少量成簇悬浮生长的幼稚DC(图4D)；第5天集落中可见表面粗糙及具有少量细胞突起的DC(图4E)；第6天时，集落中的DC开始释放及悬浮生长并逐渐出现自发成熟的倾向(图4F)，此时加入LPS进行刺激培养。第7天时，DC表面刺突清晰明显(图4G)。第8天多数DC从集落中释放，悬浮DC明显增多，形态较大且刺突明显，呈典型的树突状细胞形态(图4H)。经瑞氏染色后可见LPS刺激前(图4I)后(图4J)DC表面刺突变化明显，LPS刺激后的DC呈典型的成熟形态。流式细胞分析表明LPS刺激前DC表面表达MHCⅡ(56.4%)、B7-1(15.2%)、B7-2(21.8%)及CD11c(64.7%)，经LPS刺激成熟后MHCⅡ、B7-1、B7-2表达率上调，分别为84.0%、71.6%、74.0%(图5)。

2.4重组慢病毒对小鼠骨髓源DC的感染效率测定 将收获的第6天DC用重组慢病毒LV-NC以不同的MOI进行感染并培养72 h以使转基因充分表达。荧光显微镜下观察显示随着感染MOI的增加，表达GFP的DC逐渐增多(图6)，同时流式细胞分析结果也表明感染效率的提高，在MOI为5、10、20、40、60时感染效率分别为7.1%、25.3%、62.2%、72.8%及86.4%。

2.5重组B7-2基因RNAi慢病毒感染对DC表面B7-2表达的沉默效果分析 参照阴性对照慢病毒对DC的感染效率，重组慢病毒LV-139、LV-425、LV-848及LV-NC以MO为80感染DC及培养72 h，流式分析各组重组慢病毒对DC表面B7-2的干扰效率，结果显示(图7)：感染效率进一步提高至90%以上，LV-139、LV-425、LV-848感染后DC表面B7-2分子的表达率分别下降至4.3%、3.8%和6.3%，而LV-NC感染组B7-2分子表达率无明显变化(73.2% vs 71.0%)。根据以上结果确定LV-425为具有最佳干扰效果的小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒。

图1 小鼠B7-2 RNAi重组慢病毒表达载体测序结果Fig.1 DNA sequencing of recombinant lentiviral vector specific for mouse B7-2 RNAi

图2 慢病毒包装过程中GFP的表达(48 h，×100)Fig.2 GFP expression in lentivirus packaging progress(48 h，×100)

图3 重组慢病毒滴度测定(×100)Fig.3 Titration of recombinant lentivirus(×100)

图4 体外培养的小鼠骨髓源DC形态的变化(×400)Fig.4 Morphological changes of mouse BM-DCs in progress of culture in vitro(×400)

图5 小鼠骨髓源DC的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of mouse BM-DCs

2.6重组B7-2基因RNAi慢病毒感染及沉默DC表面B7-2表达对DC免疫性能的影响 收获LPS刺激成熟和经LV-425或LV-NC感染的DC作为刺激细胞，以小鼠脾脏T细胞作为反应细胞，二者比例为 1∶10 进行混合淋巴细胞反应，共培养72 h后采用MTT测定细胞增殖的状况，结果显示(图8)：LV-425感染及沉默B7-2表达后DC刺激T的增殖能力显著下降(P<0.05)。

图6 重组慢病毒LV-NC对小鼠骨髓源DC的感染效率Fig.6 Infection efficiency of recombinant lentivirus LV-NC on mouse BM-DCs

图7 小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒对小鼠骨髓源DC表面B7-2分子表达的沉默效果分析Fig.7 Silencing efficiency analysis of recombinant lentivirus for mouse B7-2 gene RNAi on expression of membrane B7-2 molecules in mouse BM-DCs

图8 重组慢病毒感染抑制小鼠骨髓源DC诱导的T细胞增殖反应Fig.8 Inhibitory effects of recombinant lentivirus on mouse bone marrow derived dendritic cell induced T cell proliferationNote: *.P<0.05.

3 讨论

1973年，Steinman等[7]首次从小鼠脾脏中分离出DC，随着研究的不断深入，DC在免疫应答调节以及免疫耐受诱导中发挥的功能逐渐被重视[3,4]。未成熟DC具有强大的抗原摄取及加工处理能力，但由于其表面MHCⅡ、B7-1、B7-2、ICAM-1、CD40等弱表达，不能为T细胞活化提供有效的第一信号和共刺激信号，从而导致特异性T细胞无反应、发生凋亡或产生调节性T细胞进而诱导免疫耐受的发生[5]。由于未成熟状态的DC具有致免疫耐受的能力，因而采用基因修饰的方法维持DC的未成熟状态或部分抑制其免疫刺激能力，能够在器官移植排异和自身免疫病的防治中起到积极的作用[8]。

慢病毒载体介导的RNAi技术具有慢病毒的感染细胞谱广泛、可感染分裂期和静止期细胞、高感染效率等特点以及RNAi的特异性沉默性能，成为DC基因修饰及诱导免疫耐受的理想手段[2]。

B7-2是B7家族的重要成员和经典的共刺激分子，该分子与T细胞表面的CD28结合所转导的细胞信号对于免疫反应初期T细胞应答与否具有关键作用，是T细胞启动免疫所必需的[3,4]。因此，本研究选择B7-2作为DC修饰和免疫干预的靶点，构建小鼠B7-2基因RNA干扰的shRNA重组慢病毒载体，采用四质粒慢病毒载体系统(LV-H1-GFP-B7-2-shRNA、GAG/POL、LV-REV及LV-VSV-G)共转染293T细胞进行慢病毒的包装制备。由于本研究中的慢病毒系统使用的是水泡性口炎病毒G糖蛋白(Vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSV-G)改型的包膜质粒，使得重组慢病毒颗粒的稳定性提高[9]，因此，我们采用超高速离心的方法对其进行浓缩以提高滴度，随后本研究采用可以反映具有感染活性病毒的细胞生物学方法测定病毒滴度。

为进一步研究小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒对DC表面B7-2分子表达沉默效果和诱导其免疫耐受的作用，我们从6～8周龄的C57BL/6小鼠胫骨、股骨中分离富含CD34+干/祖细胞的骨髓细胞，采用细胞因子(GM-CSF、IL-4)诱生法进行诱导培养，根据DC的半黏附生长，T、B细胞及粒细胞悬浮生长，而巨噬细胞黏附生长的特性，在骨髓细胞培养48 h后轻轻晃动培养板以使T、B细胞及粒细胞悬浮进而吸弃，培养至第6天用LPS刺激48 h，集落中细胞体积增大，表面突起明显，并逐渐从集落中释放，吹打培养板使疏松贴壁的细胞充分悬浮，即获得大量DC。经显微镜下动态观察及瑞氏染色鉴定，本法制备的DC表面刺突明显，为典型的成熟状态。同时本研究选择CD11c、MHCⅡ、B7-1及B7-2组合标记以鉴定所培养的DC，流式分析结果显示其表达率分别达68.5%、84.0%、1.6%及77.40%，该DC在混合淋巴细胞反应中也显示出了刺激小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的能力，说明本方法成功制备的DC为成熟的功能性DC。

慢病毒载体既可感染分裂细胞又可感染静止期细胞，对DC有较高的感染效率[10]，本研究制备的重组慢病毒以不同MOI感染DC，通过GFP标记观察转基因的表达情况并流式分析病毒感染效率，结果表明，随着MOI的增加其感染效率逐渐升高，经过优化条件后感染效率可达90%以上。

本研究随后采用小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒LV-139、LV-425、LV848及LV-NC感染小鼠骨髓源DC，结果显示：其表面B7-2分子的表达率由71%分别下降至4.3%(LV-139)、3.8%(LV-425)及6.3%(LV-848)，而LV-NC感染组B7-2表达无明显变化(73.2% vs 71.0%)，这表明了本研究制备的小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒可有效沉默B7-2分子的表达。同时混合淋巴细胞培养的结果显示：经筛选获得的具有最佳效果的小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒(LV-425)感染后可以显著抑制DC刺激小鼠脾脏T细胞增殖的能力，说明该重组慢病毒诱导的B7-2沉默能抑制B7-2所介导的共刺激信号与DC刺激T细胞免疫应答的能力，使DC获得免疫耐受性能。

综上，本研究制备了针对小鼠B7-2基因RNAi的重组慢病毒，其可高效感染体外诱导小鼠骨髓源DC、沉默DC表面B7-2表达及诱使DC具备免疫耐受性能。本研究为采用慢病毒载体介导B7-2基因沉默的方式修饰DC及诱导其免疫耐受应用于病理性免疫耐受失衡的自身免疫性疾病、器官移植排异治疗研究提供了新的实验依据。