抑制免疫抑制因子COX-2对视网膜神经节细胞凋亡的影响及p38MAPK信号的调控作用

崔春梅 李月华 刘 颖 陶 勇

(首都医科大学附属北京朝阳医院眼科，北京 100020)

多种眼部疾病及肿瘤压迫、机械性损伤等可引起视神经损伤，患者的视神经严重损伤后可引起视神经的萎缩，易造成失明，目前临床上有效的治疗视神经损伤的方法不多，且达不到预期的效果[1,2]。视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells，RGCs)位于视网膜底层，有研究显示，视神经损伤、糖尿病视网膜病变、青光眼等多种疾病均可引起RGCs的凋亡，而RGCs在受损的视神经中的再生比较困难[3-5]。因此，如何降低视神经受损后RGCs的凋亡成为研究热点。环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是环氧合酶的诱导酶，在炎症过程中发挥重要作用，可促进血管的生成，因而成为血管增生性疾病治疗的一个新型候选药物。此外，也有多项研究发现，COX-2可导致视网膜的损伤[6,7]。NS-398是COX-2的一种选择性抑制剂，有研究显示，NS-398可降低NMDA诱导的视网膜神经节细胞层神经元凋亡，从而对视网膜起到保护作用，也可抑制视网膜新生血管形成[8,9]，但NS-398如何调控RGCs生物学特性目前还未清楚。RGC-5细胞在RGCs研究中有广泛应用，有多种细胞凋亡模型，如H2O2损伤模型、高血糖损伤模型等，其中H2O2细胞凋亡模型在基础研究中应用最为广泛，且在大量研究中也使用此模型研究RGCs凋亡。因此，本研究建立H2O2诱导RGC-5细胞凋亡，检测NS-398对细胞活力及凋亡的影响，并进一步探讨对p38MAPK信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1材料 视网膜神经节RGC-5细胞购自美国ATCC；H2O2(10 mol/L)购自广州化学制药厂；NS-398(纯度>98%)购自美国Sigma，用DMSO溶解；SB203580购自上海西宝生物科技；DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶、MTT和NS-398购自美国Sigma公司；细胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、p53、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)、p-p38抗体均购自美国Cell signal公司；膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司；酶标仪购自瑞士TECAN公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 取出在液氮罐中保存的视网膜神经节RGC-5细胞的冻存管，37℃水浴解冻，细胞解冻后用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行常规培养，观察到细胞达到80%～90%生长密度时可进行传代。实验为生长至对数期的细胞。

1.2.2H2O2损伤模型建立 接种RGC-5于96孔板，培养24 h后以0、200、300、400、600、800 μmol/L的H2O2浓度处理细胞，培养箱内继续培养，培养7 h后将原培养基吸出，加入含有MTT溶液的DMEM培养基(不含血清)继续培养细胞4 h以使细胞能与MTT充分反应，吸出MTT后加入150 μl的DMSO溶液，振荡器振荡混匀10 min，酶标仪测定各浓度的细胞吸光度值(A值)，计算细胞存活率。实验重复3次。

1.2.3COX-2抑制剂NS-398对H2O2诱导的RGC-5细胞活力的影响 实验分为3组：即空白对照组(DMSO+含有10%胎牛血清的培养基培养细胞7 h)、H2O2组(DMSO+含有400 μmol/L的H2O2及10%胎牛血清的培养基培养细胞7 h)、H2O2+NS-398组(含有400 μmol/L的H2O2及100 μmol/L的NS-398培养细胞7 h)。每孔细胞中加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，于培养箱内4 h，加入DMSO溶液150 μl，振荡器上充分混匀10 min，酶标仪测定A值，计算细胞存活率。实验重复3次。

1.2.4COX-2抑制剂NS-398对H2O2诱导的RGC-5细胞凋亡的影响 收集按照1.2.3分组培养7 h的细胞，磷酸盐缓冲液洗涤细胞，胰酶消化细胞3 min，观察到细胞变圆时，吹打细胞使细胞悬浮在消化液中，含血清的培养基终止细胞消化，细胞消化完全后离心，轻轻吸取上清，加入200 μl的Loading buffer制备成单细胞悬液，置于避光环境中加入FITC标记的Annexin V和PI各5 μl，避光环境中反应15 min，1 h内用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。实验重复3次。

1.2.5蛋白质印迹(Western blot) 各组细胞中加入适量裂解液于冰上裂解30 min提取细胞总蛋白，BCA试剂盒对蛋白样品进行粗略定量，4∶1比例混匀蛋白样品与上样缓冲液，100℃煮沸变性5 min，每孔道取等量蛋白样品行SDS-PAGE，电泳后电转移至PVDF膜，室温5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃孵育PCNA、p53、p38、p-p38及内参GAPDH抗体过夜，洗膜，加入二抗37℃孵育2 h，洗膜，ECL显色液显色，置于暗室中显影曝光条带。

1.2.6COX-2抑制剂NS-398对H2O2诱导的RGC-5细胞p38MAPK信号通路的调控RGC-5细胞经H2O2、NS-398和p38MAPK信号通路抑制剂SB203580(10 μmol/L)处理，细胞分为H2O2+NS-398组和H2O2+NS-398+SB203580组，参照1.2.3和1.2.4方法检测两组细胞的活力和凋亡率。

2 结果

2.1不同浓度H2O2对RGC-5细胞活力的影响 不同浓度的H2O2处理RGC-5细胞后，通过MTT法检测各组细胞活力，结果如表1所示，与0 μmol/L组比较，不同浓度的H2O2均可抑制RGC-5细胞活力，且随H2O2浓度升高细胞的活力降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。由于400 μmol/L的H2O2可抑制一半的细胞活力，选择作为研究对象。

2.2COX-2抑制剂NS-398对H2O2诱导的RGC-5细胞活力和凋亡的影响 通过MTT法检测COX-2抑制剂NS-398对H2O2诱导的RGC-5细胞活力的影响，流式细胞仪检测各组细胞凋亡，结果如图1所示，与空白对照组比较，H2O2组细胞活力显著降低，凋亡率显著升高，与H2O2组比较，H2O2+NS-398组细胞活力显著升高，凋亡率显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3COX-2抑制剂NS-398对H2O2诱导的RGC-5细胞PCNA、p53、p38、p-p38蛋白表达的影响 通过Western blot检测 COX-2抑制剂NS-398对H2O2诱导的RGC-5细胞增殖相关蛋白PCNA、凋亡相关蛋白p53及p38和p-p38的蛋白表达，结果如图2所示，与空白对照组比较，H2O2组PCNA表达显著降低，p53和p-p38的表达显著升高，与H2O2组比较，H2O2+NS-398组PCNA表达显著升高，p53和p-p38的表达显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。三组间p38的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同浓度H2O2对RGC-5细胞活力的影响

Note：Compared with 0 μmol/L,1)P<0.05.

图1 COX-2抑制剂NS-398对H2O2诱导的RGC-5细胞活力和凋亡的影响Fig.1 Effect of COX-2 inhibitor NS-398 on activity and apoptosis of RGC-5 cells induced by H2O2Note: A.Cell viability；B.Detection results of flow cytometry;C.Cell apoptosis rate in each group.Compared with the control group,*.P<0.05;compared with the H2O2group,#.P<0.05.

图2 COX-2抑制剂NS-398对H2O2诱导的RGC-5细胞PCNA、p53、p38、p-p38蛋白表达的影响Fig.2 Effect of COX-2 inhibitor NS-398 on expression of PCNA,p53,p38 and p-p38 proteins in RGC-5 cells induced by H2O2Note: 1.Control group;2.H2O2group ;3.H2O2+NS-398 group.A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of each protein.Compared with the control group,*.P<0.05;compared with the H2O2group,#.P<0.05.

图3 COX-2抑制剂NS-398通过p38MAPK信号通路对H2O2诱导的RGC-5细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of COX-2 inhibitor NS-398 on apoptosis of RGC-5 cells induced by H2O2through p38MAPK signaling pathway

图4 COX-2抑制剂NS-398通过p38MAPK信号通路对H2O2诱导的RGC-5细胞PCNA、p53、p38、p-p38蛋白表达的影响Fig.4 Effect of COX-2 inhibitor NS-398 on expression of PCNA,p53,p38 and p-p38 protein in H2O2induced RGC-5 cells through p38MAPK signaling pathwayNote: A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of each protein.1.H2O2+NS-398 group;2.H2O2+NS-398+SB203580 group.Compared with the H2O2+NS-398 group,*.P<0.05.

2.4COX-2抑制剂NS-398通过p38MAPK信号通路对H2O2诱导的RGC-5细胞活力和凋亡的影响 各组细胞活力及凋亡率检测结果如图3所示，与H2O2+NS-398组比较(68.77±5.22)%、(3.63±0.37)%，H2O2+NS-398+SB203580组细胞活力(86.46±6.17)%显著升高，细胞凋亡率(2.44±0.31)%显著降低，差异具有统计学意义(t1=3.792，t2=4.270，P<0.05)。

2.5COX-2抑制剂NS-398通过p38MAPK信号通路对H2O2诱导的RGC-5细胞PCNA、p53、p38、p-p38蛋白表达的影响 各组细胞中PCNA、p53、p38、p-p38的蛋白表达结果显示，与H2O2+NS-398组比较，H2O2+NS-398组+SB203580组PCNA的蛋白表达显著升高(t=6.940,P<0.05)，p53和p-p38的蛋白表达均显著降低(t1=8.197，t2=6.063，P<0.05)，两组间p38的蛋白表达差异无统计学意义(t=0.388，P>0.05)。见图4。

3 讨论

细胞凋亡是细胞的一种自然死亡过程，既可由生理性引起，也可由病理刺激引起[10]。有研究证实，RGCs的死亡可通过细胞凋亡的方式，Caspase、p53等细胞内部基因均可直接对细胞凋亡进行调控，而外部因素则可通过信号转导途径对细胞凋亡进行调控[11,12]。氧化应激为一种细胞外部因素，参与白内障、青光眼、干眼症、角膜炎等多种眼部疾病[13-15]。H2O2为一种引起细胞凋亡的介质，可通过氧化应激引起细胞凋亡，也有多项研究证实氧化应激可引起RGCs的凋亡[16]。COX-2主要分布于核膜，内皮素、生长因子、促肿瘤剂等多种因素均可引起COX-2基因的表达，COX-2的高表达可参与多种生理及病理过程[17,18]。有研究显示，在糖尿病大鼠模型中随着诱导时间延长，COX-2的表达升高，COX-2在大鼠角膜新生血管中表达升高，而美洛昔康可抑制其作用[19]。NS-398为一种新型的COX-2的抑制剂，可特异性的抑制COX-2在细胞内的表达，有研究显示，在研究角膜新生血管模型中，NS-398可降低COX-2表达，通过阻断VEGF和PGE2的产生而抑制角膜新生血管化[20,21]。但NS-398对RGCs的影响还未清楚。

本研究中通过H2O2刺激RGC-5，建立H2O2诱导RGC-5细胞凋亡，检测NS-398对细胞活力及凋亡的影响。结果显示H2O2可降低RGC-5细胞的活力，诱导细胞凋亡，而NS-398可提高细胞活力，降低细胞凋亡。这提示COX-2的抑制剂NS-398可降低由H2O2诱导的RGC-5细胞的凋亡，提高细胞活力。p38MAPK信号通路是细胞内一条重要的信号系统，活化的p38信号通路可引起细胞的免疫反应及炎症，或引起细胞凋亡、衰老等，在糖尿病视网膜病变形成及发展中有重要作用[22,23]。SB203580为p38MAPK信号抑制剂，有研究显示，SB203580可通过对下游p53、PCNA等因子的调节减轻糖尿病鼠视网膜RGCs凋亡及破坏[24]。

PCNA是细胞分裂增殖的一个必要条件，现多用其作为细胞增殖评价的指标[25]。p53为一个促进细胞凋亡基因，在对青光眼模型RGCs凋亡进行观察时，可发现细胞上有p53的表达[26]。本研究结果显示，H2O2可上调磷酸化的p38和p53表达，下调PCNA表达，而NS-398可降低其表达。RGC-5细胞加入SB203580可增加细胞活力，降低细胞的凋亡，上调PCNA表达和下调p53表达。这提示COX-2抑制剂NS-398可通过调控p38MAPK信号影响RGC-5细胞生物学特性。

综上所述，抑制免疫抑制因子COX-2表达可通过调控p38MAPK信号通路提高视网膜神经节细胞活力和抑制细胞凋亡。其对细胞增殖及凋亡的影响方式是上调PCNA表达和下调p53表达。该研究为视神经损伤治疗提供了一定的理论基础，但本研究内容有限，还需更多的研究证实。