超声功率在马铃薯渣酶解工艺中的应用

额日赫木，邓慧清，张 琪，杨亚萍，崔 娜

（山西师范大学食品科学学院，农产品加工与贮藏实验室，山西临汾 041004）

马铃薯是世界上四大粮食作物之一。2010年，全世界马铃薯的总产量达到了3.2×108t左右，而且生产量和消费量都呈上升趋势[1]。中国是世界上最大的马铃薯生产国，占世界生产量的近1/4[2]。马铃薯块茎中淀粉含量占湿基总质量的15%左右，作为高级淀粉已被广泛用于医药、化工、食品等诸多领域[3]。而马铃薯渣是加工淀粉后的主要副产物，是由细胞碎片、细胞壁残余物、残余淀粉颗粒及细胞壁、薯皮细胞或细胞结合物等构成[4]。半纤维素作为薯渣中的主要成分之一，其含量占薯渣干基总质量的14%左右[5]，因此具有较高的再利用价值。目前，国内外对于马铃薯渣的利用已进行了诸多研究报道，主要集中在如生产燃料级酒精、生产动物饲料、提取果胶和膳食纤维等方面[6-10]，但关于马铃薯渣半纤维素的开发利用方面的报道甚少。

超声波作为非热物理技术，已被广泛应用于食品领域中。它是物质介质中的一种弹性机械波，利用其振动能量，可以在介质中产生强大的剪切力和高温，来改变物质的组织结构、状态及功能[11]；空化效应、热效应和机械作用是超声技术应用的理论依据，而空化效应被认为是最重要的理论依据，其可以导致充气气泡的产生及微射流的出现[12]。近年来，超声波技术在食品工业中得到了较好的应用，如在食品酶类研究中尤为广泛[13]。一些研究证实通过改变超声处理条件可以改变酶活性。例如，超声波处理可以提高液体α-淀粉酶的酶学活性[14]、提高胰蛋白酶的酶解效率[15]、降低果胶甲基酯酶活性等[16]，这些研究为超声波在酶学活性研究提供了很好的理论基础。

试验利用超声波预处理半纤维素酶，试图提高其酶活性，从而使马铃薯渣半纤维素的酶解效率得到提高。首先，考查半纤维素酶的最佳酶解条件，即pH值、水浴温度及水浴时间对酶活性的影响；其次，考查超声处理条件（超声功率、超声处理时间）对半纤维素酶活性产生的影响；最后，考查超声处理后的半纤维素酶在不同放置时间内的活性变化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

晋薯16号马铃薯，产自山西吕梁；3,5-二硝基水杨酸（化学纯），上海弘顺生物科技有限公司提供；葡萄糖（分析纯），南京化学试剂股份有限公司提供；半纤维素酶（食品级，活性2 000 U/g)，上海宝丰生化有限公司提供。

PHS-25型数显pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；752型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司产品；TD5G型离心机，湖南凯达科学仪器有限公司产品；FS-1200N型超声波处理器（20 kHz频率，1 200 W，最大功率Ф20 mm变幅杆），上海生析超声波有限公司产品；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液的配制

（1）DNS试剂的配制。参照朱海霞等人[17]的研究并加以改动。准确称取6.5 g的3,5-二硝基水杨酸，用蒸馏水充分溶解待用。准确称取40 g的氢氧化钠用蒸馏水充分溶解，冷却后移入500 mL容量瓶定容，得到浓度为2 mol/L的溶液备用。将上述水杨酸溶液移入1 000 mL的容量瓶中，并加入325 mL的氢氧化钠溶液，再加入15 mL丙三醇溶液待溶解后定容到 1 000 mL刻度，并移入棕色试剂瓶中贮藏（4℃） 待用。

（2） 乙酸-乙酸钠缓冲溶液的配制。准确量取11.55 mL的冰乙酸，定容量1 000 mL，即得到浓度为0.2 mol/L的乙酸溶液；准确称取16.4 g的无水乙酸钠，溶于蒸馏水后定容量1 000 mL，即得到浓度为0.2 mol/L的乙酸钠溶液。由此分别配制不同pH值的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

（3）马铃薯渣和半纤维素酶溶液的制备。马铃薯洗净后切块，打浆过滤，滤渣经流水冲洗数次去除淀粉、蛋白质等杂质，再经蒸馏水洗净3次得到残渣（湿质量），将残渣置于鼓风干燥箱在75℃条件下干燥12 h。再将干物质粉碎，过筛（100目），后同等温度下再次干燥2 h后置于密封干燥器中。准确称取1.01 g的上述干燥样品，移入100 mL的烧杯中，加入75 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行搅拌溶解，再将其移入到100 mL容量瓶中定容至刻度，得到1%的样品溶液备用。根据所用pH值的不同，再分别利用乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制质量分数为0.1%的半纤维素酶溶液（现配现用）。

1.2.2 试验设计

（1）半纤维素酶作用条件筛选。考查pH值、水浴温度、水浴时间等条件对半纤维素酶活性的影响。以马铃薯渣的酶解产物中还原糖浓度值来表示半纤维素酶活性值（由于未确定酶解反应时间，计算酶活性无意义）。

半纤维素酶解反应条件的设计见表1。

（2） 超声波处理条件的筛选。考查超声功率和超声时间对半纤维素酶活性的影响。将300 mL的质量分数为1%半纤维素酶溶液移入500 mL的烧杯中，再将其置于超声波处理装置内，在不同超声条件下进行处理，变幅杆探头进入酶溶液深度为1 cm。由于超声处理过程中溶液温度会升高而可能导致酶活性发生变化，因此在全过程中进行冷却处理。

表1 半纤维素酶解反应条件的设计

超声波处理系统见图1，超声波预处理条件的设定见表2。

（3） 半纤维素酶活性在不同放置时间内的变化。在相同的超声波处理条件下，对半纤维素酶进行超声波处理，在室温下（25℃） 放置0，0.5，1.5，2.0，2.5 h，考查其酶活性的变化。

1.2.3 葡萄糖标准曲线的制作

图1 超声波处理系统

表2 超声波预处理条件的设定

参照赵凯等人[18]的研究并加以改动。准确称取0.5 g葡萄糖溶解于蒸馏水中定容到500 mL容量瓶中，即质量浓度为1 mg/mL。按表3进行操作，将溶液混匀后置于沸水浴中加热并保持5 min。经冰水冷却后分别向各试管中加入4 mL蒸馏水，充分摇匀。以试管编号1作为空白对照，于波长540 nm处测定各样品的吸光度，并绘制出吸光度-葡萄糖质量浓度曲线。

葡萄糖标准曲线的制作见表3。

表3 葡萄糖标准曲线的制作/mL

以葡萄糖质量浓度为X轴、吸光度为Y轴，进行线性回归，并求得线性回归方程：Y=0.887 4X-0.003 2，R2=0.997 2。

葡萄糖标准曲线见图2。

图2 葡萄糖标准曲线

1.2.4 半纤维素酶活性的测定

参照谢现英[19]研究并加以改动。将质量分数为1%的薯渣溶液1 mL移入10 mL的刻度试管中，加入质量分数为0.0.1%的半纤维素酶溶液0.5 mL，置于水浴锅中加热反应；再加入1 mL的DNS试剂，置于沸水浴中反应15 min。待冷却至室温后将反应溶液定容至10 mL，于波长540 nm处测定其吸光度。

对照组加入质量分数为1%的马铃薯渣溶液1 mL，再加入蒸馏水0.5 mL，其他条件则不变。

半纤维素酶活性定义：在一定条件下，1 min内1 g半纤维素酶分解马铃薯渣所产生的还原糖（以葡萄糖计） 量（mg）。

根据以上标准曲线得出葡萄糖质量浓度，则

式中：C——葡萄糖质量浓度，mg/mL；

V——定容后的体积，mL；

0.000 5——每次反应所用的酶量，g；

t——反应时间，min；

4——稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 马铃薯渣酶解条件的筛选

不同pH值对还原糖质量浓度的影响见图3。

图3 不同p H值对还原糖质量浓度的影响（n=5）

由图3可知，半纤维素酶分解马铃薯渣半纤维素所得的还原糖制质量浓度在pH值为5.5时显示最大值，即0.339 mg/mL，然而其与pH值5.0和pH值6.0时相比，并无显著性差异（p＞0.05）。因此，可以确定半纤维素酶在pH值5.0～6.0时具有较好的酶解能力，得到的还原糖质量浓度值越大，表明半纤维素酶活性就越高。姜立春等人[20]研究表明，pH值为6.5时半纤维素酶活性最大，即此时分解底物所得的还原糖质量浓度最高。而薛海曌[21]在研究中表明，在pH值为5.0时，半纤维素酶活性达到最大值。由于pH值的变化会影响酶分子的空间构象，而可能导致酶活性发生改变，继而使酶解反应速率发生改变。因此，可以判断半纤维素酶的最佳酶解pH值应在5.0～6.0。

不同水浴温度对还原糖质量浓度的影响见图4。

图4 不同水浴温度对还原糖质量浓度的影响

由图4可知，半纤维素酶分解马铃薯渣半纤维素产出的还原糖质量浓度，随着水浴温度的提高，出现先升高后降低的趋势。水浴温度在50℃时，产物还原糖质量浓度显示最大值，即0.362 mg/mL，这表明此时半纤维素酶活性最高。而水浴温度为60℃时，产物还原糖质量浓度虽然出现下降，即0.349 mg/mL，但与 50℃相比较并无显著性差异（p＞0.05）。相关研究如杨立霞等人[22]表明，2种半纤维素酶，即β-木聚糖酶和β-甘露聚糖酶都在50℃时显示最高活性值。而魏晓飞等人[23]研究发现，β-葡聚糖酶的酶学性质随着酶解温度的变化而发生改变，当酶解温度为37℃时，β-葡聚糖酶呈现最高活性。由此可见，半纤维素酶最佳反应温度取决于酶的种类和含量，当半纤维素酶处于多种类混合状态时，其最佳酶解温度可能发生不同程度的改变（如图4所示）。因此，根据产物还原糖质量浓度，可以确定半纤维素酶的最佳酶解温度为50～60℃。

不同水浴时间对还原糖质量浓度的影响见图5。

图5 不同水浴时间对还原糖质量浓度的影响

由图5可知，随着水浴时间的延长，半纤维素酶分解马铃薯渣半纤维素所得还原糖质量浓度会增大，但超过25 min时略有降低。水浴时间为25 min时，产物还原糖质量浓度显示最高值（0.381 mg/mL），然而在15～45 min时，产物还原糖质量浓度并无显著性差异（p＞0.05）。从节能的角度考虑，水浴时间在15 min时，半纤维素酶能够有效地酶解马铃薯渣半纤维素。

综上所述，根据马铃薯渣半纤维素分解所得产物还原糖质量浓度，可选择pH值为5.0～6.0，水浴温度为50℃，水浴时间为15 min时，为半纤维素酶的最佳酶解条件。这表明在此条件下半纤维素酶具有最高的酶学活性和酶解效率。

2.2 超声波预处理条件的筛选

超声功率对半纤维素酶活性的影响见图6。

图6 超声功率对半纤维素酶活性的影响

由图6可知，超声功率增加至360 W时，半纤维素酶活性开始增大，当超声功率增加至600 W时，酶活性显示最高值（203 mg/g·min），与未经超声处理的酶溶液相比，其活性提高了23.35%。而超声功率超过600 W时，半纤维素酶活性并未呈现升高趋势，反而会出现下降趋势。超声处理条件不同，对酶类活性产生的影响也是不同的[24]，如木瓜蛋白酶在超声功率为40 W时，与未超声处理酶溶液相比，其活性提高了9%[25]；而一些研究表明，POD酶、ATP酶等其活性会随着超声功率的增加而降低[26]。酶活性的高低主要取决于酶分子空间构象的合理程度，高强度超声处理酶溶液时会产生瞬态空化作用，热效应及机械作用，而酶分子在强大的剪切力和冲击波的作用下，分子空间结构可能被改变，如二级结构的组成变化（α-螺旋、β-折叠、γ-转角等）、三级结构次级键的变化、分子形态变化等都可能是酶活性被改变的原因[27]。

超声处理时间对半纤维素酶活性的影响见图7。

图7 超声处理时间对半纤维素酶活性的影响

由图7可知，半纤维素酶活性随着超声时间的延长，呈现先上升后下降的趋势，超声时间为8 min时显示最高活性（205.46 mg/g·min），这与未处理酶溶液相比，其活性提高了33%。然而在4～8 min其酶活性并无显著性差异（p＞0.05），因此可选择4 min为最佳超声时间。由于连续的超声波场致效应改变了酶分子的空间构象，可能使其活性中心更多的暴露并与底物结合，从而导致了酶活力在0～8 min内逐渐上升。当时间延长至10 min时，酶活性开始呈现下降趋势，这可能由于长时间的超声波场致效应，导致其分子空间结构进一步被改变，甚至活性中心结构被破坏。张永军等人[28]研究表明，在超声时间为5 min时，木瓜蛋白酶活性与未处理相比，其活性提高了19%。石文奇等人[14]研究表明，当超声功率为80 W，超声时间为4 min时，α-淀粉酶活性显示最大值。因此，这些研究证明在适当的超声处理条件（如功率、时间等）下可以改变酶学活性，并同时取决于酶的种类。

2.3 半纤维素酶活性在不同放置时间内的变化

不同放置时间对半纤维素酶活性的影响见图8。

图8 不同放置时间对半纤维素酶活性的影响

由图8可知，随着放置时间的延长半纤维素酶活性呈现下降趋势。经超声波处理的半纤维素酶在放置时间为0～0.5 h内，其酶活性并无显著变化（p＞0.05），依然保持着较高的酶活性 （194～195 mg/g·min）。然而，随着放置时间的延长（1.0～2.5 h） 半纤维素酶活性呈现降低趋势，而与未处理酶溶液相比，仍然多保持了19%以上的酶活性（p＜0.05）。由此可见，超声波处理后的半纤维素酶在2.5 h的放置时间内仍然保持了较高的活性。

综上所述，在超声功率为600 W，超声时间为4 min时，半纤维素酶显示最高活性。超声波处理后半纤维素酶在放置时间为0～2.5 h内，与未经超声处理的半纤维素酶相比仍然保持了较高的活性。除超声功率和超声时间外，半纤维素酶浓度及底物（马铃薯渣）浓度也是影响酶解速率的2个主要原因。然而，为了避免酶浓度过高或底物浓度过低而掩盖超声处理的作用，因此本研究中分别使用了质量分数为0.1%的半纤维素酶及质量分数为1%的底物。而这一结果已通过预试验得以证明。

3 结论

结果表明，半纤维素酶分解马铃薯渣半纤维素的最佳作用条件是pH值为5.0～6.0，水浴温度为50℃，水浴时间为15 min。超声功率为600 W，超声时间为4 min时，可作为半纤维素酶的最佳处理条件。在此条件下，半纤维素酶可将马铃薯渣中的半纤维素更加快速酶解为还原糖。同时，在超声波处理后的0～2.5 h内，与未经超声波处理的半纤维素酶相比仍然保持着较高的活性。

通过超声波预处理后半纤维素酶活性得到了有效的提高，从而使马铃薯渣的酶解效率得到了提高。试验为食品副产物的综合利用提供了理论依据，同时也拓展了超声波技术在食品酶类研究中的应用。