小鼠诺如病毒分子生物学研究进展*

赵 娜 赵歆伊 孟 琦 邱雯贤 何 滨 马小龙 张艳淑 姚 林, 李 爽

(1.华北理工大学实验动物中心，唐山 063210)(2.华北理工大学基础医学院，唐山 063210)(3.华北理工大学公共卫生学院，唐山 063210)

实验动物的质量与动物实验能否顺利进行关系非常密切，我国《实验动物 微生物学等级及监测》(GB 14922.2—2011)规定无特定病原体(Specific pathogen Free，SPF)级别小鼠须排除11种病毒，但仍会因动物本身携带其他病原微生物而干扰实验结果。据报道，小鼠诺如病毒(Murine Norovirus，MNV)已经成为目前实验小鼠感染率较高的一种病毒，免疫缺陷小鼠感染后发生炎症反应甚至死亡[1]，对科研工作危害极大[2-3]。本文就小鼠诺如病毒的分子生物学特点及其复制进行综述。

1 小鼠诺如病毒的分子生物学特点

1.1 基因组

小鼠诺如病毒属于嵌杯状病毒科(Caliciviride)诺如病毒属(Norivirus)，与人源诺如病毒(Norwalk virus，NoV)的生物学及遗传特性相似。MNV基因组长约7.5 kb，为正义单链RNA，在其5′末端基因组和亚基因组RNA与病毒非结构蛋白NS5或病毒的末端结合蛋白(Viral protein genome-linked，VPg)共价连接，而3′末端为polyA结构[4]。基因组由三个开放阅读框(Open reading frame，ORF)组成。之后有学者在ORF2内发现了ORF4，其被认为编码毒力因子[5]。ORF1编码6个非结构蛋白(5′-NS1-2-NS3-NS4-NS5-NS6-NS7-3′)，其翻译成的一个多聚蛋白被蛋白酶NS6切割产生成熟的与复制相关的病毒蛋白。ORF2和ORF3分别编码衣壳蛋白(Capsid protein，VP1和2)，VP1和VP2是组成病毒粒子的结构蛋白。ORF4编码的毒力因子-1(Virulence factor-1，VF1)在感染小鼠中发挥重要作用，然而该蛋白在其他诺如病毒中未被发现。

1.2 病毒蛋白

1.2.1非结构蛋白

目前，MNV的许多单个蛋白的功能尚未被阐明，它们的作用通常是根据保守的基序和已知的亚细胞定位从相关的病毒和序列分析数据推断的，但肯定的是这些蛋白质与其他正义单链RNA病毒编码的蛋白质一样为多功能蛋白质。

尽管NS1-2的功能尚不明确，但是转染实验表明其定位于内质网(Endoplasmic reticulum，ER)和高尔基体，可能参与了高尔基体的分解[6]。研究发现NS1-2影响细胞内相关蛋白的运输和表达，Ettayebi和Hardy的研究证明NS1-2能够阻止水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)G-糖蛋白在细胞表面的表达，提示NS1-2可能具有潜在的免疫逃避作用。NS1-2可通过与囊泡相关膜蛋白A(Vesicle-associated membrane protein A，VAP-A)和分泌途径的其他组分的相互作用破坏细胞内蛋白质运输的能力[7]。ER和高尔基体的重排被认为有助于募集宿主膜和蛋白质以促进病毒复制复合物(Replication complex，RC)的形成，有利于病毒复制[8]。在病毒感染过程中观察到MNV NS1-2在RC内的ER和dsRNA定位，表明NS1-2是RC的重要组成部分[9]。

NS3为2C样蛋白，与小核衣壳蛋白家族的2C蛋白具有序列同源性和相似的基序，其包括核苷三磷酸酶(NTPase)基序，因此提示NS3可具有NTPase功能。Pfister等[10]发现NS3可以在体外与三磷酸腺苷(ATP)结合，但是不具有解开合成的DNA-RNA异源双链的能力，因此显示它不具有解旋酶活性。尽管在感染期间这些结构还未被观察到，但已经证明单独的MNV NS3蛋白表达形成水泡状结构并引起细胞内膜的变化[6]。

通过对NS4内部疏水性区域的预测发现，它能与膜C-末端结合，被认为是定位在ER的p30类似物[10]。与NS4类似的脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)3 A蛋白可以通过抑制ER-高尔基细胞运输引起免疫逃避[11]。研究发现MNV NS4转染细胞后定位于ER和高尔基膜，且与NS5能相互作用[12]。

NS5在病毒转录、翻译和衣壳化中具有重要作用。与小核糖核酸病毒(Picornavirus)和杯状病毒科成员相似，gRNA和sgRNA都与5′端的帽结合蛋白(Cap-binding protein)类似物NS5/VPg连接[13]。NS5/VPg的消耗或抑制的研究揭示其在翻译复合物的募集以及翻译起始中具有主要作用，结构解析研究已经显示VPg形成具有灵活的N端/C端的螺旋核心，这对蛋白质功能的多样性十分重要[14]。研究显示MNV VPg能够结合翻译起始因子eIF3和eIF4G1，进一步说明NS5在翻译起始复合体中的作用[15]。

NS6是病毒编码的半胱氨酸蛋白酶，可将ORF多聚蛋白切割成单独的蛋白质和一些中间产物(包括NS6-7前体)。NS6和中间产物NS6-7可以优先在不同位点裂解ORF1[16]。与其他RNA蛋白酶类似，NS6以顺式和反式切割多聚蛋白以产生多聚蛋白和成熟的单个NS蛋白[17]。在包括MNV在内的杯状病毒科成员中，ORF1内的5个切割位点已被确认为保守的切割位点[9]。在病毒感染期间，NS6主要定位于RC；当单独表达时，NS6显示定位于线粒体[6]，其功能可能与丙型肝炎病毒(HCV)和甲型肝炎病毒(HAV)蛋白酶相似，可以通过切割线粒体抗病毒信号传导蛋白(Mitochondrial antiviral signalling protein，MAVS)抑制抗病毒信号传导[18]。

在大多数情况下，病毒感染细胞中NS6-NS7前体蛋白被进一步加工产生病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)NS7。NS7催化基因组和亚基因组的正反义RNA转录。NS7和NS6-7前体蛋白在复制过程中已经被证明具有生物学活性，在复制周期中的不同时间点，它们都可能发挥着更重要的作用[19]。NS7的晶体结构显示其不同条件下可表现出不同的酶活性[20]。

1.2.2结构蛋白

VP1是病毒主要的衣壳蛋白(58～60 kDa)。VP1由N端臂，衣壳域(Shell domain，S)和突变域(Protruding domain，P)组成，形成“杯状”结构。S和P通过一个灵活的铰链区域连接。病毒粒子需要衣壳蛋白的180个分子形成38 nm的衣壳，其显示为T=3的二十面体对称[21]。

ORF3编码的VP2是一种小的碱性蛋白，与病毒粒子成熟相关。VP2具有高度可变性，尽管关于其在复制中的作用知之甚少，但发现VP2在VP1表达和基因组的调节中起一定作用。研究显示尽管VP2对VLP组装是非必需的，但是对VLP的稳定性有一定影响。与VP1相比，VP2的翻译速度慢且效率低，每个病毒粒子中仅存在1～2个VP2拷贝，而VP1有180个拷贝[22]。

2 小鼠诺如病毒的复制

病毒基因组复制必须借助宿主翻译机制翻译病毒非结构蛋白，特别是RNA依赖性RNA聚合酶(NS7)和蛋白酶(NS6)。基因组RNA作为非结构蛋白的初始翻译模板，而结构蛋白VP1、VP2和VF1分别主要是从亚基因组RNA中翻译[4]。

同正义单链RNA病毒一样，MNV基因组复制依赖于产生的反义中间体作为正义基因组RNA的模板。正义或反义的基因组和亚基因组RNA复制的启动具有VPg依赖性。正义基因组RNA合成是由VPg启动通过病毒RdRp(NS7)进行合成的，VPg同时为反义模板3′末端的蛋白质引物。RdRp通过MNV中保守的酪氨酸残基(Y26)将VPg共价结合到基因组和亚基因组RNA的负义模板链的起始核苷酸上[23]。亚基因组RNA与最后2.4 kb的基因组RNA相同，与VPg和ployA连接。目前认为启动亚基因组RNA合成的机制有两种，分别是提前终止和内部启动。亚基因组RNA的启动子由高度保守的茎环结构组成，位于NS7编码区VP1的上游。Lin等[24]发现该启动子以及一个短模板序列优先被MNV的RdRp识别，并确保能与RdRp稳定结合。MNV VPg已经被证实与翻译复合物的组分相互作用，如eIF4F，eIF3和帽结合蛋白，其中eIF4F在VPg启动病毒蛋白翻译中的作用尤为重要[13]。VPg和eIF4G的C-末端之间的相互作用是高效翻译所需要的，另外VPg和eIF4F核心组分构成的Poly A结合蛋白(Poly-(A)-binding protein，PABP)在MNV复制中发挥重要作用。

此外，位于ORF编码区侧翼的非编码区(Untranslated regions，UTR)可能是通过与翻译调控相关的宿主蛋白(包括La，PTB和DDX3)相互作用进行基因组RNA翻译。研究发现当UTR与宿主细胞蛋白的相互作用被抑制时病毒复制减少。这种相互作用被认为通过促进病毒RNA环化来诱导5‘和3’末端UTR上互补序列的结合来促进病毒复制[25]。

一旦募集到宿主细胞翻译复合物，MNV的非结构蛋白被翻译成单个多聚蛋白，进一步被病毒蛋白酶NS6切割成单独的NS蛋白。研究发现，MNV的蛋白酶具有保守的残基H30和C139，这些保守的氨基酸残基对维持蛋白酶活性必不可少。May等[26]发现NS6在不同的切割位点的切割效率不同，导致NS2-3和NS3-4的切割速率高于NS4-5，NS5-6和NS6-7。最近发现裂解位点上游的残基P4-P2′是一个重要的切割信号，负责控制酶的效率，从而导致有偏向性的切割。病毒RdRp在内的非结构蛋白在成功翻译和加工后，含有所有NS蛋白以及VP1和VP2的病毒RC在宿主细胞的胞质中形成。MNV RC为点状灶，定位于微管组织中心(Microtubule organizing center，MTOC)。其中VP1与乙酰化微管蛋白共定位，表明细胞骨架可能参与细胞内RC的定位。RC与感染后形成的宿主细胞膜复合物和病毒诱导的膜囊泡相关，这些膜结构可能从宿主细胞的ER和高尔基体衍生而来，并被重新分配到RC[27]。研究发现，MNV的NS1-2和NS4在细胞中过表达时直接影响高尔基体和蛋白质分泌，两者共定位于ER和高尔基体，表明其在宿主的膜表达及再分配中发挥一定的作用[6]。