从南极嗜冷游仆虫中提取的分子伴侣GroES特点分析

刘凌冲

(长春科技学院，吉林长春 130600)

1 概述

1.1 温度对物种生存的重要性

温度对物种的生存、分布及数量有极大的影响，从分子生物学角度可以对温度对物种分布的影响进行阐释。在细胞和分子层面，轻微热量的改变能造成深远的影响，如细胞的酶活性、蛋白稳定性和转运、大分子聚合反应、细胞膜流动性、细胞分泌和神经信号传递等。在两极地区，土层寒冷，全年的温度都低于5℃。大片的土地都是冻土，只有夏天的几周是解冻的土壤。微生物对温度变化特别敏感，尤其在不同地区的温度变化。影响生物生长的一个重要因素就是酶催化的适合温度。每个酶的活性都有其最适温度，低于最适温度，有些催化反应的功能就会停止，当温度逐渐上升，催化效率也随之上升并趋近于最适温度。温度每提升10℃，催化反应速度翻一番。然而，超过一个固定点，再继续升温，生物的生长就会变慢，当温度很高时甚至会致命。高温对微生物的损害主要体现在酶变性、载体转运过程破坏，并影响其他蛋白质功能。温度对微生物细胞膜同样有显著的影响:在极低的温度下，细胞膜会凝固；在高温，磷脂双分子层会溶解分离。

1.2 极端微生物

极端微生物是一种生活在极端的温度、酸碱度和盐度中的微生物的总称，从中可以获取一些极端条件下的酶用于生产和应用。极端微生物根据它们生长环境的不同和产生酶的应用的不同，可以将它们分为嗜热菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜冷菌和嗜压菌。这些不同种类的极端微生物在地球的不同地方存在，海底、火山，两极到赤道，地球最冷的和最热的地方都有它们的存在。

1.3 嗜冷菌的特点及其重要性

区分嗜冷菌和冷耐受性菌是通过它们不同的生长温度。嗜冷菌在0℃长势良好；在15℃或者以下有最适增长，最大值在10℃左右。嗜冷菌来源于北冰洋和南极，因为90%的海洋都是5℃或高点，这是嗜冷菌的居住环境。嗜冷微生物在很多方面都适应了环境。

1.4 游仆虫

终年寒冷的南极大陆沿岸海域拥有大量真核微生物，它们中的大部分是纤毛虫属，尤其是嗜冷微生物游仆虫（Euplotesfocardii）。游仆虫是研究生物适冷性的理想材料。游仆虫隶属原生动物门纤毛纲游仆科，是单细胞真核生物。由于它们结构简单、易于操作、低温条件易生存（最适生长温度4～5℃）、容易在实验室控制培养等特点，所以游仆虫是研究冷适应性理想的工具。

2 材料与方法

2.1 供试材料

游仆虫野生菌株TN1[6]是从南极洲特拉诺瓦湾沿岸水域的海水样品和混沙沉积物中被分离出来的。

RNaseA，购自北京西美杰科技有限公司。

2.2 试剂与仪器

微量离心管（江苏康健医疗、冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、异丙醇（上海沪静生物科技有限公司）、乙醇（上海抚生实业有限公司）、考马斯亮蓝（上海华蓝化学科技有限公司）、AquaPure Genomic DNA kits 732-6340上海天崛电子科技有限公司、SEDI梯度PCR仪（WEALTEC）、Mini GES迷你水平电泳槽（WEALTEC）、紫外分光光度记（Mettlertoledo）、SDS溶液（青岛捷世康生物科技有限公司）。

2.3 游仆虫Euplotesfocardii的培养

游仆虫TN1野生株系是从南极Terra Nova沿岸水域的海水样品和泥沙沉积物中被分离出来的。它的细胞是以Danaliellatertiolecta为食物并且在2～4℃增长。在此温度下，细胞表现出显著的增殖率。在盐水中4-5℃被培养，在4℃繁殖率是大概每四天分裂一次。

2.4 游仆虫Euplotesfocardii细胞基因组DNA的提取

使用纯水基因组DNA试剂盒（AquaPureGeomic DNA）提取基因组DNA流程如下。

2.4.1 细胞收集

慢速离心已收集约2×106细胞，加入平衡后的35%NaCl溶液中，转移入1.5mL离心管。于1600r/min离心5s以收集细胞。弃去上清液，留取20μL残液。

2.4.2 细胞裂解

大力旋转细胞悬浮颗粒。为了裂解细胞，将300μL 细胞裂解液（Genomic DNA lysis Solution）加入细胞悬浮液中，并且仔细得用移液管上下吸取数次以促进细胞裂解。

2.4.3 RNA酶处理

将1.5μL RNA酶A溶液4mg/mL加入细胞裂解液中。颠倒离心管25次，以彻底混合样品并且在37℃培养1h。

2.4.4 蛋白质沉降

待样品温度降至室温，将100μL蛋白质沉降溶液加入细胞裂解产物中。剧烈振荡20s使蛋白质沉降溶液与细胞裂解产物充分融合。然后在1600r/min离心3min以分解沉淀蛋白和细胞碎片。

2.4.5 DNA沉降

将含有DNA的上清液转移入新的灭菌处理的1.5mL离心管中，加入300μL100%异丙醇溶液并上下反复颠倒50次。然后在1600r/min将样品离心1min以产出DNA白色沉淀，上清液被丢弃，DNA沉淀放在干净的吸收纸风干。之后，加入300μL70%乙醇溶液以冲洗DNA沉淀并反复多次颠倒，并在1600r/min离心1min，然后弃去上层乙醇溶液。最后将试管倒置在干净的滤纸上风干10～15min。

2.4.6 DNA溶解

DNA悬浮颗粒被干化，100μL DNA水溶液加入DNA悬浮颗粒液，并且在室温下过夜培养以为了DNA水化。紫外光吸收范围从260nm到280nm以测试DNA纯度和质量，A260/A280在1.7～2.0。最后，DNA在-20℃储存。

2.5 引物设计

PCR扩增中使用的引物见表1。

表1 引物设计

2.6 PCR扩增

针对两个不同的引物，我们设置两个循环

2.7 样品DNA纯化

2.7.1 调试DNA结合条件

混合1体积的样品和2体积的NT缓冲液。

2.7.2 结合DNA

将核酸萃取物放入收集管中，装满样品。在11000r/min离心1min，弃上清液于收集管中。

2.7.3 洗刷硅胶膜

加入600ulNT3缓冲液。在11000r/min离心1 min。弃去上清液重新将核酸萃取物放回收集管中。

2.7.4 干化硅胶膜

在11000r/min离心2min以除去NT3缓冲液，确保离心管无残留液。由于包含乙醇的NT3缓冲液会影响下一步反应。所以要在72℃风干2～5min。

2.7.5 洗提DNA

将核酸萃取物放入干净的1.5mL微量离心管中。加入15～50μLNE洗脱缓冲液或者离子水在室温下静置1 min以提高纯化DNA的产量。然后再在11000r/min 离心 1 min。

2.7.6 跑电泳及基因测序

纯化后的DNA沉淀用聚丙烯凝胶电泳（SDSPAGE）的方法跑出所需的基因条带进行剪切，并拿到测序公司进行测序。利用测序后的序列结果进行特点分析。

3 结果

3.1 从游仆虫中提取的GroES的序列分析

冷适应分子机制的研究，在基因表达和蛋白序列的层面。游仆虫的转录子包含454个序列并用BLAST方法搜索分析出来。对应真核生物的GroES可以发现两个重复的序列从这些重复序列，分析出两个起始子:

>Ef_groES1 MSIAFKKLNPLLNRVLVKRAEAVTKT TGGIILTQEKDMSYGTVVAHGPGVAEESGFRTTCVKIG DTVLLPSWEGQGVELNGEELSIYRDTDIMGILSEEVL

>Ef_groES2 MLNFRRVQPLLNRVLVKKVEVAQKSI GGIILSARDTPPANIGTVIDVGPGTTDRDGKHRECFVNV GDVVLLPEHAGAKIELADESEFYLFRDDDIIGVLSDRI

3.2 冷适应性分析

>Ec_GroES1 MSISFKKLSPLLNRVLVKRAAASTTSA GGIILTEEKEMAYGEVVAHGPGVSEEGGFRDTCVKKG DTVLLPSWEGQKIELNGEELSIYRDTDILGILSEKVQ

>Ec_GroES2 MLNFRRIKPLMNRVLVKKVEVPSKSA GGILLKVTEAEKSNVATVIDVGPGTTDREGNFRKTFVNV GDIVLLPETQGRKIEMADKSEFYLYRDDDIIGVLSEAV

对比这些序列揭示了从游仆虫中的两个GroES序列只有45%相同，然而EFGroES1有80%与ECGroES1，EFGroES2有68%与它的厚游仆虫的异源体相同。

4 结论

论文研究的目的是研究嗜冷微生物游仆虫中提取的特异性功能基因分子伴侣GroES，并对其进行冷适应性分析。研究表明，从游仆虫中提取的GroES基因表达蛋白质趋向于提升脯氨酸，天冬氨酸，组氨酸，和精氨酸的含量；降低谷氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的含量。而脯氨酸、天冬氨酸、组氨酸等正是与微生物的抗冻性相关的蛋白质组成，提升这些氨基酸的同时也提高了多肽链分子的灵活性，这对在低温下行使酶反应的性能非常重要。更多的实验还需要验证这个假设:如果是真的，就会提高细菌中蛋白质表达的含量，尤其是真核生物中的抗冻蛋白。以此生产更多的生物催化酶，通过原核生物的繁殖特性提高抗冻蛋白的工业生产的效率。