隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究进展

王 钧，刘 妍，徐东平

HBV感染可引起不同的临床表现，如无症状携带者、急慢性乙型肝炎（乙肝）、肝硬化、肝细胞癌以及肝衰竭等[1]。20世纪70年代，研究者发现了一种新型的临床HBV感染状态，即感染者的HBV核心抗体（抗-HBc）IgG阳性但HBsAg阴性。后来随着高度敏感的分子生物学检测方法的发展，隐匿性HBV感染（occult HBV infection,OBI）的临床类型和概念逐渐被定义[2]。OBI与输血传播风险、疫苗免疫失败以及肝病潜在进展风险密切相关[2]。但其临床特点尚不明确，需要更多的研究去探讨OBI在高风险人群以及临床就诊人群中的发生特点。目前已有的OBI相关数据显示，有些群体被认为是发生OBI再激活的高风险人群，如接受免疫抑制治疗的HBV既往感染者。为了预防OBI传播，应该在献血者、免疫抑制患者、器官移植捐献者和接受者中进行HBV DNA筛查[3]。本综述主要结合近年来OBI相关文献，对OBI的定义和流行率、发生机制及临床意义进行阐述。

1 OBI定义和流行率

2008年在意大利举办的研讨会中研究者明确定义血清HBsAg阴性，肝组织中HBV DNA阳性（血清中HBV DNA阳性或阴性）为OBI[4]。2019年Liu等[5]提出了新的OBI概念：血清HBsAg阴性，肝组织HBV 松弛环状的双链DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）和/或共价闭合环状DNA分子（covalently closed circular DNA, cccDNA）阳性，单跨缺口或双跨缺口PCR可以特异性扩增rcDNA和/或cccDNA而非整合DNA。虽然根据肝组织HBV DNA阳性定义OBI最准确，但在临床实践中肝组织不易获得且缺少标准化检测方法。随着血清HBV DNA检测的标准化和灵敏度提高，当前临床研究中经常把OBI定义为：HBsAg阴性，血清HBV DNA阳性。若HBV DNA无法获得或者怀疑存在间歇性病毒血症时，血清抗-HBc单独阳性也要考虑OBI的可能[4]。本文所引研究中OBI定义稍有不同，为血清HBsAg阴性，DNA阳性（血清或肝组织）。

OBI可以分为两类：①血清学阳性OBI，即抗-HBc和/或抗-HBs阳性，这类OBI患者占多数。一般发生在急性肝炎后HBsAg阴性或者在慢乙肝感染期间HBsAg清除时。②血清学阴性OBI，即抗-HBc和抗-HBs阴性，这类OBI患者约占20%。因为S基因突变或抗-HBs进行性减少至消失，感染初始血清中抗-HBc和抗-HBs就以隐匿性状态存在[4]。

不同研究中的OBI发生率不同。中国西北部6706例年龄＜12岁的社区儿童中，1192例HBsAg阴性，其中OBI的发生率为1.260%（15/1192），主要基因型是B型和C型[6]。中国厦门的一项研究发现，38 499例献血者中有61例OBI患者，发生率为0.158%（61/38 499）[7]。法国圣安东尼大学医院对过去7年间就诊的3966例患者（同时有HBV DNA定量和HBsAg、抗-HBc、抗-HBs结果）研究发现，其中OBI发生率为1.200%（47/3966）[8]。Liao等[9]研究揭示中国宝鸡地区献血者中OBI发生率为0.054%（60/11 0843），而张凯等[10]在6996例肝病患者中共筛选出12例OBI患者，发生率为0.172%（12/6996）。

2 OBI发生机制

2.1 病毒因素 HBV PreS/S基因突变会影响HBsAg的表达、分泌和抗原性，进而降低血清中抗体对抗原的结合效力，导致免疫逃逸[11]。OBI患者HBV突变可能会导致其复制力降低，使血清和肝组织内HBV DNA水平更低或检测不到，而低病毒复制力反过来又会影响HBsAg的表达和分泌[12]。此外，有研究报道HBV基因组甲基化也与OBI形成有关[13]。

HBsAg主要亲水区（major hydrophilic region,MHR） 为aa99～169。其中的“α”决定簇（aa124～147）基因突变是导致OBI发生的一个主要原因。“α”决定簇是病毒重要的中和表位，该区基因突变会引起蛋白结构改变，影响HBsAg的抗原性[14]。已有实验证明“α”决定簇经典的sG145R突变会降低抗体与HBsAg的亲和力，导致OBI发生[2]。最近，Zhang等[15]验证了9株OBI相关的HBsAg MHR突变（6株来自OBI相关肝癌患者，3株来自OBI献血者）可降低HBsAg抗原性，导致HBsAg商业试剂检测力下降。此外，PreS1/PreS2启动子基因突变也会导致OBI患者的HBsAg降到试剂检测不到的水平[2]。还有研究发现与HBV野生株相比，4种HBsAg MHR N-糖基化突变会降低HBsAg抗原性且其中3种新型N-糖基化突变株对6种HBsAg检测试剂的反应性降低，表明MHR N-糖基化突变可能是引起患者OBI表现的原因之一[16]。

2.2 宿主因素 宿主免疫反应和遗传因素也与OBI的发生相关，可能是通过控制HBV活动，抑制HBsAg和其他HBV分泌的蛋白，以及提高免疫突变的基因屏障等方面影响HBV。其中最受关注的是调控免疫反应中起重要作用的HLA，其多态性被认为是决定HBV感染患者预后的重要因素[13]。

宿主表观遗传修饰也可能与OBI相关，宿主细胞微小RNAs（microRNAs, miRNAs）可以调控一些宿主基因的表达并对HBV复制和抗原表达发挥作用。研究报道，HBV特异性血清miRNAs可以较准确地在人群中鉴定筛选出OBI患者（敏感性99.9%，特异性99.8%），但该研究样本量（OBI组11例）较小，存在一定局限性[17]。

2.3 其他因素 有研究表明，其他病毒的感染也会影响OBI发生，如慢性HCV感染对HBV有抑制作用。IFN-利巴韦林治疗HCV感染时，患者的HBV DNA水平会上升，但当HCV水平突破时，HBV DNA水平反而会下降。体外实验也证明了HCV核心蛋白对HBV复制和表达有抑制作用[13]。

3 OBI的临床意义

3.1 OBI和输血 曾有研究报道，无症状的献血者输血也会造成HBV传播，后来经证明是OBI引起的，这些献血者的血清中检测不到HBsAg，但有反复波动的低水平病毒血症[18]。2015年在意大利发现了2例输血后获得肝炎的病例，且供受者HBV序列高度同源[19]。也有研究鉴定了10对献血供、受者的HBV DNA 具有99%的序列同源性，证实了OBI的血液传播性[20]。Liao等[9]的研究证实了HBV PreS/S免疫逃逸突变是与献血者OBI相关的重要因素，其中位于MHR的sS117T、sT118K、sT131N、sT134Y/L和sD144E突变发生率显著高于对照组。中国厦门的一项研究表明OBI组S基因MHR突变发生率显著高于HBV携带组，MHR的13种突变中有4种（sC124R、sC124Y、sK141E、sD144A）会显著降低7种HBsAg检测试剂的敏感性，有10种突变（sG119R、sC124Y、sI126S、sQ129R、sS136P、sC139R、sT140I、sK141E、sD144A、sG145R）在HuH7细胞和小鼠中会显著降低病毒颗粒和/或S蛋白的分泌[7]。因此提高OBI献血者的检出率对于降低HBV输血传播风险非常必要。

3.2 OBI和疫苗失败 我国新生儿乙肝疫苗接种计划自1992年起在全国实施，虽然有效降低了HBV感染率，但也并不能完全阻断HBV感染。部分HBsAg阳性母亲所生婴儿免疫阻断后虽然HBsAg阴性且符合目前HBV母婴阻断成功的标准，但其血清中的HBV DNA检测阳性，提示这些婴儿免疫阻断后存在OBI[21]。国内一项纳入了158例出生后接受HBV疫苗主动免疫和高效价免疫球蛋白被动免疫的新生儿（母亲均为HBsAg阳性）的研究显示，这些新生儿在7月龄时虽然HBsAg均为阴性且抗-HBs阳性，但其中有32例血清HBV DNA中位水平为1.97（1.20～3.71）log10IU/ml，OBI检出率高达20.3%（32/158）。另外随访数据显示，这32例OBI新生儿在12、24和36月龄时HBV DNA阳性率分别为25.0%（8/32）、21.9%（7/32）和7.7%（2/26，6例缺失）。其中有31例患儿曾在某个随访点检测不到HBV DNA（4例在24月龄、2例在36月龄又检出低水平HBV DNA）；另有1例随访期间HBV DNA一直低水平复制。结果提示OBI与母婴传播疫苗阻断失败密切相关[22]。

3.3 OBI与肝脏疾病进展 很多研究认为OBI是促进肝脏疾病进展（肝硬化和肝癌）的一个重要危险因素[2]，但是目前两者之间的具体关系并未完全明确。

3.3.1 肝硬化 OBI也是造成肝硬化的主要原因之一。国外一项研究表明OBI在病因未明的隐匿性肝硬化患者中较常见，且OBI可能会导致该类患者病情加重，由隐匿性肝硬化进展为失代偿肝硬化[23]。OBI造成肝损伤的机制还未明确，但是一些研究数据表明肝细胞内HBV cccDNA的持续存在和转录以及细胞因子（例如TNF-α和IFN-γ）的产生都可能会导致肝细胞损伤[24-25]。HBV X区突变的发生会引起X蛋白反式激活能力下降，导致HBV DNA低水平复制和血清HBsAg阴性[2]。

3.3.2 肝癌 乙肝和丙型肝炎都是肝癌进展的主要危险因素。在肝癌患者的肝细胞核内可检测到持续存在的HBV cccDNA。OBI引起肝癌发生，可能有以下机制：HBV DNA整合进入宿主基因组，整合的HBX和截短的PreS2/S基因序列可以改变细胞的基因表达，导致肝癌发生。而且OBI患者中HBV游离的基因形式和整合的基因形式都能够以低水平复制、转录、合成蛋白[2]。Chen等[26]研究发现1例晚期HBV相关肝癌患者的OBI临床表现是由其感染的多种S基因突变病毒株引起的，其中一些S基因突变可以影响病毒的表型特点，可能与肝癌进展密切相关。李奇等[27]对1株来源于典型OBI患者的新型HBV MHR突变株“aa126～127‘RPCMNCTI’插入”进行了体外细胞水平致瘤性实验，发现这种新型突变HBV S基因具有促进肿瘤生长的细胞生物学特点，可能是慢性HBV感染向肝癌进展的潜在风险因素。

HCV感染的肝癌患者中，OBI（血清HBsAg阴性，肝组织DNA阳性）发生率都在40%以上，明显高于单纯慢性HCV感染者。此外，OBI在HCV感染的肝癌患者中的比例明显高于未感染HCV的肝癌患者，可见OBI与HCV感染的肝癌发生也有相关性[21]。

3.4 OBI与HBV再激活 临床中OBI再激活大多发生在高风险患者中，HBV复制水平增加会发生暴发性肝炎[2]。

3.4.1 HBV与HCV/HIV共感染 有研究报道，HBV感染者抗反转录病毒药物撤药后，会发生HBV再激活，但在HIV阳性的患者中HBV再激活的临床意义还未明确[28]。过去几年，在采用IFN治疗为主的HBV/HCV共感染者中发生了HBV再激活现象，虽然这种情况可能是IFN直接的免疫调节作用引起的，但更可能是HCV被抑制后引起HBV复制导致的[29-31]。由于IFN也可以抑制HBV复制，因此关于其引起的HBV再激活的研究相对较少。直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agents, DAAs）不能抑制HBV复制，其在治疗慢性HCV感染合并OBI的患者时也可能发生HBV再激活，引起急性肝炎，增加肝衰竭的风险[32-35]。有研究报道，与IFN相比，采用DAAs治疗的慢性HCV感染合并OBI患者，HBV再激活现象发生得更早也更加有临床意义，提示对于DAAs治疗的慢性HCV感染者，明确其合并HBV感染还是OBI并对其进行干预管理具有重要意义[29]。

3.4.2 OBI与肝移植 对于终末期慢性肝病患者，肝移植是目前惟一的治疗选择，但是对于存在OBI的肝移植受者，免疫抑制因素会引起HBV再激活现象增加而且会迅速导致移植失败和死亡[36]。有研究表明血清抗-HBc是潜在的OBI新型血清标志物之一。如有研究通过检测抗-HBc阳性患者的HBV DNA水平明确OBI的存在[37]。Tandoi等[38]对HBsAg阴性且抗-HBc阳性患者的肝组织进行研究，发现60%的患者可以检测到cccDNA，其中17%的患者血清HBV DNA阳性。最近Caviglia等[39]发现肝组织cccDNA阳性的肝移植供者血清抗-HBc IgG水平显著高于cccDNA阴性者，且抗-HBc IgG水平（＞ 4.4 COI）与肝组织cccDNA阳性有显著相关性，提示血清抗-HBc IgG水平将可能作为免疫抑制患者中OBI再激活的一种风险预测指标。

3.4.3 OBI与免疫抑制治疗 血液肿瘤患者在接受造血干细胞移植以及抗-CD20（利妥昔单抗）或抗-CD52（阿伦单抗）等免疫抑制治疗后，HBV再激活的风险增高。HBV再激活时患者会由于肝衰竭或者中断特异性治疗原发疾病进展而导致其死亡。除了宿主因素，一些病毒因素也是HBV再激活的原因[40]。日本研究者在1例基因型为Bj的暴发性肝衰竭血液肿瘤患者（接受了免疫抑制治疗）中检出HBV基因组前核心区终止突变（A1896）[41]，埃及和意大利的研究发现HBV基因亚型D1也可能和免疫抑制治疗后HBV再激活有关[42-43]。一旦HBV再激活应立即给予有效的抗病毒治疗，研究发现拉米夫定单药治疗对于降低患者病死率基本无效，因此应选择恩替卡韦或者替诺福韦等高抗病毒效能、高耐药基因屏障的药物[40]。

4 展 望

OBI是威胁患者生命安全的全球公共健康难题，也是发展为终末期肝病的重要危险因素之一。OBI的大规模筛查花费巨大，经济负担重，尤其是对于发展中国家，因此许多存在OBI的患者尚未被明确诊断。对于OBI传播高风险人群（器官移植受者、献血者、抗-CD20化疗患者、HBV与HCV/HIV共感染患者、HBV流行地区的疫苗接种儿童等），HBV DNA定量和多价抗-HBs的HBsAg检测试剂都需要被推广，高风险的OBI患者应该在治疗前至少检查1次抗-HBc和HBV DNA，并定期监测ALT水平。未来我们需要确定不同风险人群的最佳用药时机和个体化用药方案。当前，OBI的新型血清学标志物（如抗-HBc）也越来越受到关注，更可靠、更便捷的血清学标志物的出现将有助于降低OBI筛查的成本以及OBI患者的临床风险。