HBV小鼠动物模型的研发进展

郑晓文，王 敏，冯成千，高 鸣，聂 源，邓西子，胡凤玉，李 锋

在已知的人类肝脏病毒中，HBV是独特的具有反转录过程的双链DNA病毒，其基因组全长3.2 kb，至少编码7个蛋白，包括HBcAg、HBeAg、HBsAg、聚合酶和X蛋白等。肝细胞内共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）是HBV复制模板，需要特别强调的是，HBV生命周期中cccDNA并不直接产生子代病毒DNA，而是产生一个大于基因组全长的前基因组RNA（pregenomic-RNA, pgRNA）复制中间体。pgRNA首先包裹到由核心蛋白形成的核衣壳中，然后经过聚合酶的反转录过程产生子代病毒基因组（该过程与HIV反转录复制过程相似），cccDNA 所携带的遗传信息通过这种特殊方式传递给子代病毒。随后，HBV核衣壳蛋白与细胞内质网上的表面抗原蛋白组装成为成熟病毒颗粒（42 nm颗粒）并释放出细胞，同时大量表面抗原以无核酸形式的亚病毒颗粒（17～22 nm颗粒）释放[1]。

HBV感染具有极强的种属特异性，自然界中，仅有黑猩猩和食蟹猴是支持HBV感染的非人灵长类动物。但黑猩猩感染HBV后主要表现为急性病毒肝炎，不能建立慢性感染[2]；而食蟹猴尽管可发展成慢性感染[3]，但是由于动物伦理的限制和成本的考虑，美国国立卫生研究院越来越限制非人灵长类动物在生物医学上的研究应用，故同样不适合建立HBV感染模型。此外，树鼩是另一种支持HBV感染的小型动物，其可感染HBV建立慢性感染，出现肝脏疾病[4]。利用树鼩肝细胞时还发现了HBV的受体为Na+牛磺胆酸盐协同转运多肽。但同样的，树鼩和非人灵长类动物一样具有妊娠周期长、饲养成本高、动物资源缺乏等特点[5]，在应用上受到极大限制。小鼠因其易获得、易饲养管理及经济的特点而广泛应用于各个实验室，研究者在构建HBV小鼠模型方面做了不断创新与优化，本文就HBV感染小鼠模型的相关研究作一综述。

1 HBV转基因小鼠模型

1995年，Guidotti等[6]构建了1.3倍HBV基因组长度的（HBV1.3×）转基因小鼠模型。该模型中，0.3倍HBV基因组重复片段含有pgRNA启动子和转录增强子序列，可以帮助转录产生完整的3.5 kb全长pgRNA和全部HBV产物RNA，保证HBV在小鼠的肝脏中完成产生、包装与释放的全生命过程。该小鼠的血清中可以检测到高水平HBV和病毒标志物。该模型的主要缺陷是，HBV蛋白是组成型表达，小鼠的免疫系统在发育阶段就通过阳性选择和阴性选择删除了识别HBV的免疫功能，形成小鼠无法打破的天然免疫耐受，因此小鼠中无HBV引起的肝炎以及相关的肝脏疾病。

为了克服免疫耐受，1999年，Larkin等[7]首先构建了含有HBV1.3×转基因的免疫缺陷小鼠。小鼠成年后，通过将具有正常免疫功能的同源小鼠脾脏移植到该HBV转基因小鼠中，使小鼠建立免疫系统，具备识别HBV的免疫功能。此模型中可以观察到肝损伤，可用来研究HBV引起的病理变化和宿主因素的关系。Wang等[8]在此模型基础上通过持续的CD137刺激，诱导了小鼠的肝炎，以及相关的肝脏疾病，包括肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。有研究利用该模型，通过基因表达谱分析发现，重建后的HBV特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）的数量与血清中ALT活性显著升高呈正相关[9-10]，说明了针对HBV长期的特异性免疫反应导致小鼠肝细胞损伤和高水平再生增殖。随后利用该模型还证明了蛋白酶体抑制了转基因小鼠中HBV的复制[11]，泛素可以调节HBV的复制周期[12]，先锋转录因子FoxA通过改变HBV DNA甲基化状态来调控基因表达[10]。

总的来说，HBV转基因小鼠在HBV相关研究中显示了其强大的应用价值[6]。但因转基因小鼠HBV基因组已经整合在细胞基因组中，与自然感染HBV存在差异[6-7，13]，这一缺陷限制了该小鼠模型在HBV治愈领域的应用。

2 水动力高压注射介导的HBV转染小鼠模型

1999年，Zhang等[14]报道一种通过小鼠尾静脉注射裸质粒DNA来提高外源基因在肝细胞中高水平表达的体内转染技术，其原理是通过从小鼠尾静脉快速注射大量液体，导致肝血管内压力升高，瞬时高压将质粒DNA挤进肝细胞。有研究者通过荧光素酶和半乳糖苷酶作为报告基因，证明该种方式可以获得外源基因在肝脏中的高表达[15-16]。通过水动力高压注射含有1.3倍HBV基因组的质粒，获得了非整合形式的HBV小鼠模型，在血清中可以检测到HBV颗粒和亚病毒颗粒，该模型为病毒学研究提供了极大便利[17]。但是，由于所注射的质粒DNA中含有非HBV基因组的质粒骨架，这些质粒骨架序列通常会引起较强的免疫反应，造成HBV质粒的快速清除，因此该模型的持续感染时间较短，只有几周[17]。

为了克服上述模型不稳定的缺点，2006年Huang等[18]构建了含有腺相关病毒（adenovirus associated virus, AAV）序列的质粒pAAV/HBV1.2，并将该质粒通过尾静脉水动力高压注射入C57BL/6小鼠体内。经研究发现，40%该类小鼠体内的HBsAg可持续6个月以上，且在血液和肝组织内均检测到高水平的HBV产物，证明该方法建立的HBV小鼠模型更加持久。研究者认为AAV的非转录调控序列提高了HBV在小鼠肝细胞内的稳定表达[18]。在水动力注射小鼠模型中，HBV能发挥正常的免疫功能，这扩展了其在新型免疫治疗领域和HBV在机体中发病机制免疫领域中的应用。

水动力高压注射介导的HBV转染小鼠模型具有以下缺陷：第一，对操作人员的技术稳定性要求较高，成模率相对低；第二，受水动力高压原理的限制，肝细胞转染效率较低（5%～10%）；第三，质粒骨架仍在，不能完全代表HBV真实感染状态。

3 AAV载体介导的HBV小鼠模型

人AAV是直径20 nm无包膜的复制依赖型单链微小DNA病毒[19]，其基因组长约4.7 kb，只编码Cap和Rep蛋白，病毒复制需要依靠辅助病毒腺病毒才能进行[20]。AAV有结构简单，转染效率高，免疫原性低和在宿主体内长期稳定表达的优势[21-22]。AAV载体比较成熟，整个基因组几乎可以被掏空，其rep和cap基因被替换，只须保留两端呈发夹结构并具有调控功能的反向末端重复序列（145 bp）[20]。在293细胞中可以通过共转染辅助质粒和载体质粒产生大量AAV载体[23]。2015年，Dion等[24]报道了一种基于AAV血清型2/8的肝特异性靶向的持续性HBV感染小鼠模型。通过尾静脉注射AAV-HBV（非上文所讲的高压注射），可以在肝细胞得到高转染效率的HBV表达细胞（HBcAg阳性肝细胞比例60%），血清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA病毒学指标可以持续1年以上，且在肝脏中没有明显的炎症，并可同时观察到HBV特异性免疫耐受[24]。

AAV-HBV小鼠模型中，小鼠感染率较水动力转染裸质粒DNA小鼠模型高，且HBV在肝脏的表达水平也更持久稳定，造模过程也相对简单，因此该模型应用较广。有研究者利用该模型研究发现，HBV特异性免疫耐受与血液循环中HBsAg的水平和持续时间有关，通过抗体清除血清中HBsAg可打破HBV诱导的免疫耐受，小鼠可以重新获得对HBV疫苗的保护性免疫应答[25-26]。临床上使用的HBV预防性疫苗对HBV携带者及慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者无效，无法打破机体形成的HBV特异性免疫耐受。上述发现揭示了，可以通过清除HBV携带者体内的HBsAg来打破HBV诱导的免疫耐受，使患者重新建立针对HBV的免疫应答。另外，Toll样受体9的激动剂CpG—Toll可以作为佐剂提升HBV疫苗的免疫效果[25-26]。另外，Bian等[27]通过临床观察CHB患者发现其大部分PreS1（HBV 前S1抗原）结构域免疫耐受性低，并设计了针对PreS1区域的新型HBV疫苗，在AAV-HBV小鼠模型中概念性验证了该治疗性疫苗的有效性。遗憾的是，AA V-HBV小鼠模型中没有cccDNA形成，也没有HBV感染。

4 HBV cccDNA小鼠模型

临床上，cccDNA是HBV在体内复制和停药后再复发的根本原因，清除cccDNA是CHB患者完全治愈的金标准。为了克服在小鼠中检测不到HBV cccDNA的问题，研究者们做了不同的尝试。Qi等[28]做了最早的尝试，利用Cre-LoxP重组原理，通过水动力高压同时注射Cre酶表达质粒和含有HBV 1倍基因组的重组质粒。在小鼠的肝脏细胞内，Cre酶可以利用LoxP位点将HBV 1倍基因组的重组质粒进行重组得到HBV 重组cccDNA，同时该设计还巧妙地使用了内含子序列，将残留的LoxP在基因转录水平切除，该小鼠模型中可以检测到病毒颗粒，病毒蛋白的表达。但是在该模型中，cccDNA在小鼠体内持续时间较短，主要原因为：①高压注射的质粒中含有质粒骨架，引起的免疫反应导致了质粒的清除和快速失活；②Cre酶可以持续不断的介导含有LoxP的cccDNA分子间重组，导致cccDNA的损耗和不稳定；③高压注射方法肝细胞的转染效率较低，HBV未能建立慢性感染。本课题组为了克服体内重组的问题，使用微环DNA技术在细菌培养体系中生产出了HBV cccDNA细胞[29]。但是我们将cccDNA注射到C57小鼠中，cccDNA的持续时间仅在几周之内，未能体现出cccDNA的长期存在。随后Yan等[30]发现细菌生产的HBV cccDNA在C3H小鼠品系中可获得高水平持久的HBV复制，HBV cccDNA的设计、剂量、携带HBV的基因型和不同宿主背景都有可能影响HBV在体内的复制和持久表达。2018年，Li等[31]进一步升级了Cre-Loxp系统，利用Cre转基因小鼠，通过使用腺病毒载体递送线性HBV基因组到小鼠肝脏内，通过Cre酶在肝细胞内进行重组得到HBV cccDNA。该小鼠模型中，HBV cccDNA可以持续62周以上，并在小鼠肝脏中发现持续的坏死性炎症反应和纤维化，在病毒存在的晚期阶段也经常见到发育不良的病变。由于仍旧是小鼠的肝脏细胞，该模型中HBV不能进行二次感染，因此仍不能模拟HBV感染机体的整个生命周期。

5 肝脏人源化小鼠模型

理想HBV小鼠模型是将小鼠的肝细胞置换成人的肝细胞，这样HBV就可以在小鼠中完成整个生命周期。发展人源化肝脏模型用于HBV研究大概经历了如下几个阶段。

5.1 HBV-trimera（三合）小鼠模型 1999年，IIan等[32]首次报道了人嵌合肝小鼠模型，他们首先通过高剂量辐射彻底破坏正常小鼠的造血系统，然后将重症联合免疫缺陷（severe combined immunodificiency, SCID）小鼠的骨髓细胞移植到这些小鼠中，最后将HBV感染者的肝片段移植到其耳朵或者肾包膜下，构建了HBV复制模型。在该小鼠中，可以检测到低水平短暂性HBV血症，但是由于人肝细胞持续时间较短，不能广泛应用。

5.2 Alb-uPA/SCID人源化小鼠模型 第一个真正意义上的肝脏人源化小鼠是白蛋白启动子调控尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子（albumin promoter/enhancer-regulated-urkinase plasminogen activator transgene, Alb-uPA）小鼠模型。肝内过表达的尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator, uPA）可以导致肝细胞大量死亡。2001年，Dandri等[33]和Mercer等[34]将正常人肝细胞移植到Alb-uPA/SCID小鼠中，其中人肝细胞嵌合率为15%，继而用HBV感染含有嵌合人肝细胞的小鼠，发现在小鼠血清中HBV持续存在，并且病毒滴度不断升高，说明HBV在该小鼠内可以多轮感染，实现完整生命周期。但是，由于在肝内过表达的uPA基因可导致出生后不久的小鼠出现严重肠道和腹部出血问题，并且这种损伤不受控制，人肝细胞必须在早期进行移植，以使小鼠能够存活。总的来说，该模型小鼠死亡率高，产率低，移植时间窗短限制了其应用[35-36]。

5.3 基于Fah敲除诱导程序性肝损伤的肝脏人源化小鼠模型 延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）是酪氨酸降解途径的最后一种酶，其缺失会使得肝毒性代谢产物积累进而导致肝损伤[37]。药物2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰）1，3-环己二酮[2-（2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl）-1, 3-cyclohexanedione,NTBC]可防止有毒代谢物的积累和肝毒性损伤[38]，研究者可通过调节NTBC的用量来控制肝细胞不同程度死亡。Fah-/-/Rag2-/-/Il2rγ-/-（FRG）小鼠是有着乙酰水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase,FAH）-/-、重组激活因子2（recombination activator 2, RAG2）-/-、白介素2受体γ（interleukin 2 receptor γ, IL2Rγ）-/-免疫缺陷的小鼠，为异种移植人类肝细胞提供了很好的环境[39]。因此，Azuma等[39]利用FAH-/-小鼠进一步构建了含有人源肝脏的小鼠模型，其先用尿激酶表达的腺病毒对小鼠进行预处理，24～48 h后通过脾内注射大量人肝细胞，在接下来的5 d内逐渐停用NTBC，在撤药2周后，小鼠再给予5 d的药后停药，然后通过组织学、DNA分析、小鼠血清中人类白蛋白水平测定等方法确认，该小鼠中人肝细胞移植率可高达90%。该肝脏人源化小鼠模型首次实现了肝脏在程序性调控下的重建，可以支持HBV的高水平复制[40]。我们也在NOD-Rag1-/-IL2rg-/-（NRG）免疫缺陷小鼠的基础上利用基因编辑技术构建了FAH-NRG小鼠[41]，该小鼠很容易支持人肝细胞再生，成模率高，支持HBV高水平复制[42]。基于此原理的肝脏人源化小鼠模型目前使用最广。但是，FAH小鼠需要NTBC来维持，由于肝脏内一直有肝细胞死亡，血清中有高水平ALT，NTBC的使用不当很容易导致其死亡。

5.4 基于TK 转基因诱导肝损伤的肝脏人源化小鼠模型 胸苷激酶（thymidine kinase, TK）可以在更昔洛韦（ganciclovir, GCV）作用下转化成对细胞有毒的成分，进而掺入到基因组中扰乱细胞增殖。Hasegawa等[43]利用NOD/Shi-scid IL2Rγnull（NOG）免疫缺陷小鼠开发了TK-NOG转基因小鼠。该小鼠中肝细胞可实现GCV调控下的损伤凋亡，以及随后人肝细胞的高水平重建，并可以有效支持HBV感染复制。TK-NOG小鼠是代表着HBV感染小鼠的另外一个重要分支，其临床应用比FAH小鼠更为广泛，可以用于临床药物评价。

6 总 结

经过三十多年的探索，HBV感染模型发展的越来越完善。使用免疫缺陷小鼠构建的人源化肝脏是主流方向，HBV可以在小鼠中完成完整的复制周期，目前针对HBV本身的新型药物都在这类小鼠中进行测试。但限于肝细胞和造血干细胞来源同一个体的难题，且得到免疫系统和肝脏同时重建的人源化小鼠成本较高[44]，虽有成功报道[45]，但不具有广泛使用性。另外，目前肝脏人源化的小鼠还不能用于测试基于免疫调节来控制和清除HBV的新药策略。AAV-HBV小鼠和重组cccDNA小鼠虽然不及肝脏人源化小鼠，但其含有免疫系统，现阶段正好可以弥补肝脏人源化小鼠的缺陷，是HBV研究领域的重要模型。而基于高压注射方式构建的HBV小鼠模型在分析结果解读过程中一定要考虑质粒来源和质粒骨架所引起免疫反应这个因素。