液体活检在肿瘤筛查与诊断中的应用

李 萍，俞希远，顾月清

(中国药科大学 工学院，江苏 南京 211198)

肿瘤，尤其是恶性肿瘤对人类的生命健康与财产造成了巨大的威胁，在我国，平均每8分钟就有一位居民被查出患有恶性肿瘤，而由于我国居民健康意识的缺失，80%恶性肿瘤被确诊时即已到达中晚期的症状表现，此时不仅治疗的效果欠佳，甚至部分患者已经失去了治疗的意义[1]。因此，肿瘤的早发现、早诊断、早治疗在癌症防治过程中的作用十分重要。研究表明，早期的癌症经过正规的治疗，可达到较为理想的治疗效果，甚至完全治愈。国家卫生组织建议把癌症早期筛查作为一种常规的居民体检，以将恶性肿瘤癌扼杀在萌芽之中。2011年，世界卫生组织提出，对于恶性肿瘤防治而言，40%可通过预防避免，40%可通过早期筛查提高生存率，20%可以带癌生存。

目前，临床上肿瘤诊断的“金标准”为活体组织检查及病理切片，但是获得活体组织存在许多困难，包括对患者的侵入性，以及带来的固有临床风险、潜在的手术并发症和经济损失。此外，一些肿瘤本身不可进行活检，以及手术本身会增加肿瘤转移的可能性，同时可能延迟治疗，因此活体组织检查不适合用于肿瘤的早期筛查[2]。

近年来，分子生物技术蓬勃发展，液体活检的潜力及优势逐渐显露出来。液体活检具有便捷、无创或低创、异质性低以及能提供较为全面的生物信息等优势，在肿瘤的筛查、诊断、治疗、预后等阶段均能发挥重要的监测作用，从而引起了广泛的临床关注与研究。液体活检的主要样本来源是非侵入性的体液样本，如血液、尿液、唾液等。用于肿瘤早期筛查的液体活检常用标志物有循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)，循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，肿瘤相关外泌体(exosomes)，和循环肿瘤microRNA(circulating tumor MircoRNA,ctmiRNA)等。液体活检的最大优势在于，可对微小病灶实现"实时监测"。本文总结了循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、肿瘤相关外泌体、循环肿瘤microRNA在肿瘤筛查与诊断中的应用，为液体活检技术进一步用于肿瘤筛查与诊断提供一些参考。

1 循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞(CTC)是一种外周血中检测到的由肿瘤部位(包括原发部位及转移部位)释放的肿瘤细胞。目前CTC的逃逸机制还不清晰，有研究表明可能是通过上皮-间充质转化机制逃避免疫系统，通过外周循环系统与淋巴系统进入血管中，但是CTC仅存在于肿瘤患者体内[3]。CTC的检测和分子表征是转化癌症研究中最活跃的领域之一，已有超过400项临床研究将CTC作为生物标志物。CTC研究主要包括(a)肿瘤风险的早期筛查；(b)预测转移复发或转移进展的风险(预后信息)；(c)治疗实时监测；(d)治疗靶点和耐药机制的鉴定。其中，对于肿瘤筛查，如胃癌、肺癌、前列腺癌筛查等，已有多项临床试验证明其有效性优于包括影像学在内的肿瘤筛查与检测手段。Ilie及其同事报道[4]，对患有慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的肺癌患者，在临床影像学诊断中未检测到的肺癌时，即可检测到CTC阳性(35)。该研究纳入168例(68.6%)COPD患者和77例非COPD受试者(31.4%)，其中包括42名对照吸烟者和35名不吸烟的健康人。3%的COPD患者可检测到CTC阳性(168名患者中的5名)，每年对这5名CTC阳性的患者进行低剂量CT扫描监测，分别在1至4年内检测到肺部结节，从而引导早期肺癌快速切除手术和组织病理学诊断。同时对照组中吸烟人群与不吸烟健康人中均未检测到CTC阳性与肺部病变。阐明CTC可在肿瘤发展的更早阶段检测到病变。

CellSearch、微流控等系统是最常见的CTC分离手段。Jiang等[5]收集了21例非小细胞肺癌软脑膜转移患者的脑脊液样本，利用CellSearch系统检查到20例患者的脑脊液中CTC阳性。Kang[6]发现，在102例CTC水平大于2%的受试者中，99例受试者患有肺癌，而45例CTC水平低于2%的受试者中，28例为健康人，证明CTC可以作为一种有潜力的胃癌诊断标志物。Fan等[7]对卵巢癌患者及良性卵巢疾病的受试者进行CTC检测，结果显示，在71例卵巢癌患者中检测到43例CTC阳性，而良性疾病患者中均未检测到CTC；特别地，在晚期卵巢癌患者中，CTC的计数显著高于Ⅰ-Ⅱ期患者，说明CTC检测结果可辅助卵巢癌诊断。

2 循环肿瘤DNA

循环肿瘤DNA(ctDNA)是指外周血中检测到的与肿瘤相关的非细胞DNA(cell free DNA,cfDNA)，可能由CTC释放，或是由死亡或脱落的肿瘤细胞释放。临床上与肿瘤筛查及检测的ctDNA主要有两类，DNA突变与DNA甲基化[8]。

与CTC类似，ctDNA临床应用的最大难题在于检测技术的灵敏度与特异性不足。迄今为止，许多研究团队正致力于开发灵敏度高的ctDNA检测技术。例如，Maximilian Diehn研究团队开发了一种"肿瘤个体化表达深度测序"技术(CAPP-Seq)，用于非小细胞肺癌的早期诊断(NSCLC)[9]。其设计涵盖多种cfDNA突变的检测方法，在大于95%的肿瘤患者血液样本中鉴定出突变，而检测特异性可达到96%。虽然在大多数II-IV期NSCLC患者中检测到ctDNA，但只有50%的早期NSCLC患者(I期)被鉴定出来。该检测技术检测到的I期肿瘤患者的ctDNA的丰度比晚期肿瘤患者低约10倍。在其他肿瘤中这种差异也存在。因此，需要进一步改进该技术，包括增大样本容量，以获得临床认可度更高的早期癌症检测灵敏度。

在一篇具有里程碑意义的论文中，Diehl等[10]表明，通过监测手术后结直肠癌患者血浆中的肿瘤特异性突变(包括APC，TP53和KRAS)，监测肿瘤复发的敏感性甚至可以达到100%。其他研究中，包括乳腺癌、肺癌、以及口腔鳞状细胞癌，均发现KRAS，APC和TP53突变与肿瘤复发存在一致性关系[11]。

ctDNA的另一种常见形式，DNA甲基化，在肿瘤诊断中也具有很重要的意义。RASSF1A的表观遗传失活是癌症中最常见的分子变化之一，表明RASSF1A甲基化是早期癌症检测的具有潜力的生物标志物。其异常的启动子高甲基化状态可能在指示女性乳腺癌的高风险性[12]。同时，对于临床上已发生转移的晚期患者，ctDNA检测的更大意义在于辅助监测转移灶的形成。在一项研究中，对手术切除卵巢和肠肿瘤，后产生骨转移的患者进行癌症相关基因(包括TP53，PIK3CA和KRAS)进行靶向深度测序，结果表明转移灶源自最初的卵巢癌，从而辅助制定个体化的治疗方案，避免了不必要的治疗延迟[13]。

但是，对从未患癌的健康人而言，随着年龄的增长，也可能发生DNA突变。例如，在年龄超过65岁的人群中有10%可检测到体细胞突变[14]。因此，即使检测到ctDNA，也无法确诊肿瘤，更有报道显示，ctDNA还与焦虑、辐射等因素相关[15]。

3 肿瘤相关外泌体

外泌体在肿瘤中的作用越来越受到研究者的重视。这种直接来源于细胞，并在细胞通讯中起到关键作用的细胞外囊泡，在肿瘤的发生、发展、转移、耐药过程中均有着重要意义。外泌体是细胞释放的小尺寸的囊泡(粒径为30～150nm)。1979，首次从癌症患者外周血中分离得到外泌体[16]。外泌体通过直接激活表面表达的配体或通过在细胞之间转移分子而在细胞与细胞的通讯中发挥重要的作用。肿瘤细胞释放的外泌体在肿瘤发生发展过程中的机制是“双刃剑”：既可以调节局部或全身环境，给肿瘤的生长和传播创造条件，也可以调节免疫系统引发或抑制抗肿瘤反应[17]。外泌体中富含各种蛋白质、DNA、RNA和脂质等。研究表明，细胞的RNA等遗传信息主要通过外泌体在细胞间进行传递[18]，由于外泌体稳定的脂质双层膜，RNA等遗传物质可以稳定地存在于外泌体中，进入循环系统并参与细胞间信息传递。因此，外泌体中蛋白质、核酸等物质具有很高的诊断价值。温等[19]从胆囊癌的外泌体中筛选出56种上调的差异miRNA和130 种下调的差异miRNA可作为液体活检的标志物，其中miR-552-3p上调最为显著。提示外泌体的miRNA可用于肿瘤的早期筛查与诊断。Huang等[20]比较了非小细胞肺癌患者与普通肺炎患者肺组织中的外泌体的表皮生长因子受体的表达 ( epidermal growth factor receptor,EGFR)，发现非小细胞肺癌患者的外泌体上EGFR阳性表达率高达80%，而肺炎患者肺组织的外泌体EGFR阳性表达率仅为2%，表明外泌体是一种理想的液体活检的生物标志物。

4 循环肿瘤microRNA

microRNA是一种内源性的微小(18～24nt)非编码(nc)RNA，主要作用为调节真核基因表达。迄今已经鉴定出超过2500种人类microRNA[21]，且近三分之二的基因表达都会受到microRNA的调控[22]。目前，循环肿瘤miRNA(circulating tumor microRNA,ctmiRNA)的研究领域引起了很多研究者的兴趣，并且已经以指数速度增长，目前已发表2000多篇论文。多项研究表明，ctmiRNA可以通过肿瘤来源的外泌体调控非肿瘤细胞，从而在癌症生物学中发挥作用，从而促进肿瘤发展，ctmiRNA已被证明可调节体内微环境的化学敏感性，血管生成和细胞侵袭[23]，传递与肿瘤相关的生物信息，调节肿瘤生长和转移。研究者已发现多种ctmiRNA可作为肿瘤诊断的标志物，如miR-10、miR-16、miR-21、miR-155、miR-141、miR-210、miR-221、miR-375等，在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤的早期筛查与诊断中发挥重要作用。Shimomura等[24]联合检测一组miRNA，包括miR-1246、miR-1307-3p、miR-4634、miR-6861-5p 以及miR-6875-5p，结果显示该组合检测乳腺癌的灵敏度达到97.3%，特异性为82.9%。

5 结语

虽然液体活检目前仍旧不能替代组织活检，但液体活检技术的快速发展给多种肿瘤的早期筛查与无创诊断提供了可能，多项临床研究也证明液体活检技术的潜力，包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体、循环miRNA在内的肿瘤标志物也极大地拓展了肿瘤发生、发展、转移机制的研究。但是，仍需要大量的实验数据证明液体活检技术的临床有效性，也需要更多新型技术富集低丰度的循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体、miRNA等肿瘤标志物，以支撑高灵敏度、高特异性的临床诊断。