茶叶中天然累积和人工合成的甲基化EGCG的研究进展

任晓萌，商虎，2，3，高晨曦，胡潇，黄艳，2，3，4，*，孙威江，2，3，4，*

（1.福建农林大学安溪茶学院，福建泉州362400；2.福建省茶产业工程技术研究中心，福建福州350002；3.福建茶产业技术开发基地，福建福州350002；4.福建农林大学园艺学院，福建福州350002）

我国是茶叶的故乡，茶叶加工与利用历史悠久；尤其在近代茶产业的发展过程中，科学技术不断融入这个传统行业，茶叶深加工技术及茶叶中功能性成分研究日益纵深，利用茶叶中具有生物调节活性和药理性功能的物质参与到新产品的研发中已是大势所趋[1]。多酚类化合物赋予茶叶抗氧化、清除自由基、降血脂、镇痛、抗菌消炎等生理活性，茶多酚中含量最高的儿茶素家族是茶叶药效的主要活性成分，而甲基化儿茶素系一类多元酚中六元环中氢原子被甲氧基（-OCH3）取代从而提高了其稳定性与生物利用率，特异性地增强了儿茶素的药理作用。

1929年，日本学者从茶叶中分离出儿茶素，由此先河后，各国学者对此展开探究并逐渐突破进展：1982年Sauo[2]首次在”Benihomare”茶树鲜叶中分离出一种甲基化EGCG——（-）-表没食子儿茶素3-O（3-O-甲基）没食子酸酯[（-）-epigallocatechin-3-O-（3-O-methylgallate），EGCG3"Me]，如表 1 中结构 4 所示，是一类甲基化儿茶素化合物，具有很强的抗过敏作用[3-5]。1999年，Mitsuaki Sano等[3]从冻顶乌龙茶中成功分离出EGCG3"Me，而且分离出另一种新型儿茶素衍生物——EGCG4"Me如表1中结构5所示。2001年日本茶叶试验场发现[4]了一种治疗花粉过敏症效果显著的茶种“Benifuuki”，其鲜叶中所含儿茶素是当时所有茶种中含量最高的，尤其是其中一种儿茶素的衍生物——甲基化EGCG，其含量约达到1%。

研究表明，甲基化EGCG在消炎、抗过敏性等药理作用相较于EGCG表现出更加显著的效果[3-10]。此外，由于EGCG3"Me含有甲基，使整个EGCG3"Me分子脂溶性增加，因此，EGCG3"Me其口服吸收率比EGCG高9倍[11]，同时EGCG3"Me的稳定性也比EGCG强。据此可以看出EGCG3"Me在开发保健食品、抗过敏药物以及新型功能茶等各个方面均有很大的作用，其应用前景以及医用价值均高于EGCG[12-13]。至今为止茶叶中已分离出 16 种甲基化 EGCG[2-3，14-16]。

茶叶中甲基化EGCG的含量与很多因素有关。研究指出[4]，茶叶中的甲基化EGCG所占据的比例受茶树品种、采茶标准与时间及加工工艺的共同影响。我国茶树资源较为丰富，且在茶叶加工方面优势明显。对甲基化EGCG在加工过程中的变化规律展开研究对开发新型功能茶具有现实意义。

1 甲基化EGCG类型及分子结构

甲基化EGCG是指EGCG苯环上的酚羟基被甲基醚或甲基取代而形成的一系列衍生物。在研究发现的16种甲基化EGCG中含量较多的有EGCG3"Me、EGCG4"Me，也是目前甲基化EGCG的研究热点。甲基化EGCG基本分子结构如图1、表1所示[17]。

图1EGCG化学结构式Fig.1 Chemical structure of EGCG

表1 EGCG与甲基化EGCG结构式[17]Table 1 The structure of EGCG and O-methylated EGCG

2 茶叶中天然甲基化EGCG含量的影响因素

2.1 茶树种质资源的影响

1982 年 Sauo[2]从“Benihomare”茶树鲜叶中提取分离出了EGCG3"Me后，日本科研人员对其本国的42个茶树进行了调查研究，并发现3个茶树品种的EGCG3"Me含量在1%以上，最高含量是1.516%。2001年，日本茶叶研究所[4]对30种茶树中的甲基化EGCG展开调查，研究发现在这30种的茶树中几乎不含有甲基化EGCG。2004年，据研究员Maeda-Yamamoto的研究[18]，只有在很少部分的茶树中有一定含量的EGCG3"Me，其中最高的EGCG3"Me含量占干物质的1.6%。

中国对茶树种质中的甲基化EGCG资源的开发较晚。2006年，吕海鹏等研究学者对国内200多个高多酚含量的茶树种质茶样展开调研[11]，发现在不同茶树种质中EGCG3"Me的含量有很大差异：在200多份茶样中，EGCG3"Me的含量均在1.431%以下，其中含量大于1%的占所调查茶样总量的3%，而未检测出EGCG3"Me的茶样占53%；而且高含量的EGCG3"Me茶树种质显现着区域性分布特征：在调查的广东省的30个茶样中都发现含有EGCG3"Me，福建省的42个茶样中含有EGCG3"Me的有35个，但在云南省的102个茶样中仅有9个发现有EGCG3"Me。同年，汪毅等[19]对西南地区茶树种质资源展开调研发现：在69个茶样中，中叶种的茶树中EGCG3"Me的含量占叶干重最高达到1.03%，其次为小叶种，以云南大叶种为代表的茶树中很少发现EGCG3"Me，实验还发现含有EGCG4"Me的茶树品种较少且含量偏低：测出EGCG4"Me的占检测样本总数的27.5%，其中含量最高为0.22%，最低仅0.06%。2008年罗正飞等[20]发现，EGCG3"Me在中叶型品种茶叶中含量较高，尤其是适做乌龙茶、绿茶的品种，最高达茶叶干重的1.38%；2009年SHIH-CHIEH LEE等[21]调查研究了113个台湾茶树品种，其中16个品种具有较高含量的EGCG3"Me（＞0.8%）；2010 年唐娜[22]对湖南地区的茶树种质资源展开调研，对收集的117个茶样研究发现EGCG3"Me的含量最高达1.7%，但EGCG4"Me的含量普遍相对较低：在117个茶样中，含有EGCG4"Me的茶样仅有10个，含量最高为0.55%，最低只有0.036%。2015年李建华等[23]对四川地区70份茶树质资源的新梢中EGCG3"Me含量进行分析筛选出了包括金观音在内的3 个富含 EGCG3″Me（＞10 mg/g）茶树品种。2014 年吕海鹏[24]发现云南大叶种“紫鹃”也具有较高含量EGCG3"Me的特异性。2016年Kunbo Wang[25]在福建主要适制乌龙茶的金牡丹、黄玫瑰、金观音茶树品种鲜叶中都检测出一定含量的EGCG3"Me，并且金牡丹的EGCG3"Me含量在4.25 mg/g。

日本、中国都在不同时期对甲基化EGCG的种质资源进行了深入而广泛的调查，发现甲基化EGCG含量与种质资源有关，这是今后选择性育种的发展方向，尤其是我国在种质资源中已占有优势的江南、华南茶区，高甲基化EGCG的育种方向值得探究；以及在中叶型品种中选育将有更大几率选育出高甲基化EGCG的种质。国内外甲基化EGCG种质资源见表2和表3。

表2 国内外甲基化EGCG种质资源Table 2 Domestic and foreign O-methylated EGCG germplasm resources

表3 国内地区甲基化EGCG种质资源Table 3 Domestic area O-methylated EGCG germplasm resources

2.2 采摘季节对甲基化EGCG的影响

茶叶原料的采摘影响成茶中内含物的含量。夏季气温高，光照强，茶树光合作用强，碳代谢旺盛，因此多酚物质含量较春秋二季多，而秋季由于木质化程度的影响导致其多酚物质含量低于春季。在甲基化酶的催化作用下EGCG甲基化[26]，从而使甲基化EGCG含量逐渐累积，所以呈现出甲基化EGCG含量随季节而变化的趋势，因此季节的影响与茶梢中EGCG3"Me的含量有关。汪毅[19]对4种高含量EGCG3"Me的茶树品种样品进行EGCG3"Me含量对比发现：秋茶中EGCG3"Me含量最高，其次是夏茶，春茶最少。与吕海鹏等[11]研究发现的秋季茶叶鲜叶中EGCG3"Me含量高于夏季相一致。李建华等[23]的研究发现不同季节采摘的茶鲜叶，同等叶位的EGCG3"Me含量随季节推进均呈递增趋势。而在唐娜[22]对春、夏、秋季采摘的茶叶样品分析中发现，夏季茶样的EGCG3"Me含量最高，秋茶其次，春茶最低（秋季采摘的与夏季采摘的差异不显著）。作者认为产生的差异可能不同的研究团队在采摘这些样品的时候，采摘的嫩度标准、采摘时间不统一，后二者对其含量也有影响。

2.3 采摘时间对甲基化EGCG的影响

采摘时间影响甲基化EGCG的含量主要是通过不同温度影响甲基转移酶等相关酶的活性造成酶促反应发生的速率变化从而影响生成甲基化EGCG的含量。因此在同一天的不同时间采摘茶样，会造成鲜叶中甲基化EGCG含量不同。根据吕海鹏等[27]的分析实验：鲜叶中的EGCG3"Me含量在早上8∶00最低，之后呈增加趋势，在12∶00时含量达到最高（14.83 mg/g）直至16∶00含量保持相对稳定，到18∶00其含量则有降低趋势，根据方差分析：茶鲜叶中EGCG3"Me含量在中午12∶00明显高于8时与10时，差异达到极显著水平（P≤0.01）。在其之后的研究发现[28]EGCG4"Me、EGCG3’Me和EGCG3"Me的生成量随着反应温度的升高呈现增加趋势，在35℃时其生成量达到最大值，之后随着反应温度的提高其生成量降低。由于正午的气温较高而使甲基化EGCG生成量增加而不断累积，因此为制作高含量EGCG3"Me茶，采摘鲜叶时应该在中午或16∶00前的下午进行。

2.4 采摘标准对甲基化EGCG的影响

茶树生长及新梢中内含物质呈动态变化，当新梢老化时，儿茶素含量降低，纤维素含量增加，因此采摘标准会造成新梢内含物质的差异，因此有必要对不同成熟度的叶片分析EGCG3"Me的含量差异。根据汪毅[19]分别对茶梢不同成熟度（一芽二叶、一芽三叶、一芽四叶）的鲜叶中EGCG3"Me含量进行检测分析表示：随着叶片成熟度的提高，EGCG3"Me的含量增加，一芽三叶中EGCG3"Me含量最高，但到达一定的成熟度后，因为其茎梗含量过多，叶中纤维素含量相对增加，儿茶素参与转化，因此一芽四叶中EGCG3"Me含量逐渐下降，从而与一芽二叶中其含量相当，同罗正飞等[20]的研究结论一致；在吕海鹏等[24-27]对包括“紫鹃”在内的多种茶树中与唐娜[22]对其研究的茶树种质中同样发现EGCG3"Me含量最高一般集中在茶树新梢的第三叶及第四叶中，且发现茎梗中EGCG3"Me含量极少，可能与茶梗中木质化纤维素对儿茶素类化合物有较强的吸附亲和力有关[29]。因此，为制作高含量EGCG3"Me茶，且确保茶叶的高质口感，鲜叶的采摘标准应该优选一芽三、四叶。

2.5 茶叶加工过程中甲基化EGCG的变化

茶鲜叶按不同茶类加工工序制成毛茶，其内含物都不同程度地发生了质与量的变化。茶叶的发酵是指在特殊的环境中（包括酶的作用、湿热环境所产生的作用等）茶叶内所发生的一系列氧化、水解等反应。其中最重要的是多酚氧化酶和过氧化物酶促进的氧化作用促进的茶多酚物质的变化。根据不同加工工艺分类，绿茶属于不发酵茶类，白茶、黄茶属于轻发酵，乌龙茶属于半发酵，红茶属于全发酵，黑茶属于后发酵。不同茶类的发酵程度代表着酶促反应的进行程度，从而影响着内含物质的转化，其中包括甲基化EGCG的含量变化。

不同茶类加工方式的本质在氧化程度的差异。对绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶中EGCG3"Me含量比较分析后发现：随氧化程度加重，EGCG3"Me含量呈下降趋势。汪毅等[19]研究表示所含EGCG3"Me量最多的是绿茶，其次是乌龙茶，在红茶中却很难发现EGCG3"Me。由于绿茶未经发酵，故EGCG3"Me得到良好的保有，且经过干燥后发现其含量比鲜叶中稍有所升高[11]；鲜叶加工成黄茶经过了闷黄的步骤，但发酵程度依然较轻，EGCG3″Me 含量变化差异不显著[23]，因此 EGCG3″Me含量与绿茶相近；同样，乌龙茶没有进行像红茶一样的重发酵，故EGCG3"Me含量下降较少，而且在萎凋过程中，EGCG3"Me的含量也有明显提高[11]；而且根据Feng-Lan的研究中发现在全发酵的红茶及后发酵的普洱茶中未检测到EGCG3"Me[30]。究其原因，可能由以下因素引起：茶青中的某些甲基化酶的活性可能影响着绿茶和乌龙茶中EGCG3"Me的含量变化，如发酵过程中产生某种去甲基化酶使EGCG3"Me转化为EGCG；而且红茶在制作过程中经过了以酶性氧化为主的发酵工序，EGCG3"Me的甲基容易被取代；同时EGCG3"Me也可能因为其发生氧化聚合从而导致其含量降低；况且在长时间的高温高湿状态的发酵环境下，可能导致EGCG3"Me发生降解；而且在长时间的高温与提取、灭菌的加热情况下，EGCG3"Me差向异构化为GCG3"Me，这也可能是EGCG3"Me含量急剧减少的原因之一[31]。在吕海鹏等[24]以“紫鹃”品种的一芽三、四叶为原料加工成不同茶类的研究中呈相同趋势，即EGCG3"Me的含量绿茶＞白茶＞乌龙茶＞红茶；而在孙业良的研究中，采用一芽二叶鲜叶原料制作绿茶、白茶以及乌龙茶的EGCG3"Me含量与鲜叶中的EGCG3"Me含量相差不大[32]，而且在加工制成毛茶的过程中，茶叶中EGCG3"Me含量都能保持相对的稳定。而之前的研究中已指出[11]，在乌龙茶加工的萎凋过程中，茶叶中EGCG3"Me含量显著增加，作者认为造成的结论差异可能是在加工过程中萎调时间较短，所以导致含量变化不明显。

在绿茶、白茶、黄茶加工过程中，杀青工序显著降低了鲜叶中EGCG3″Me的含量，酶遇高温失活，甲基化EGCG降解或氧化聚合等可能是含量减少的原因；揉捻增加了EGCG3″Me的含量是由于在加工时鲜叶组织受损，细胞膜破裂，细胞内的EGCG3″Me含量被提取出来[30]；绿茶加工的干燥工序使杀青叶中EGCG3″Me的含量降低[22]，绿茶是新梢通过杀青，酶失活后干燥而成，未经发酵，其化学成分与新梢类似，所以极大程度的保持了鲜叶中EGCG3″Me含量；而黄茶制作过程中杀青叶在闷黄工序过程甲基化EGCG发生轻度氧化从而少量减少，在进行干燥时其含量降低，总体上黄茶与绿茶加工过程中EGCG3″Me含量变化规律相似，其含量与鲜叶相当[23]。

在乌龙茶与红茶加工过程中，萎调工序显著增加了鲜叶中EGCG3″Me含量，可能是因为在萎调时EGCG3″Me合成酶活性提高，EGCG转化为EGCG3″Me从而含量增加[33]。萎凋工序对茶叶中的大分子化合物的进一步降解有一定的催化作用，萎凋的时间越长，EGCG3"Me的含量也呈上升趋势，EGCG3"Me的含量在萎凋时间为8 h的时候最高，在8 h之后，EGCG3"Me的含量会随着时间的增加而进一步减少。当萎凋时间为18 h的时候，EGCG3"Me的含量甚至不足初始的一半[19]。在之后的乌龙茶做青、杀青工序中含量差异不显著，但均显著低于萎凋叶中EGCG3″Me含量，揉捻使杀青叶中的EGCG3″Me含量显著增加，但之后的干燥工序使其显著降低[23]。总体来说，乌龙茶加工中的甲基化EGCG发生中度氧化，鲜叶中EGCG3″Me含量显著降低；在红茶的揉捻、发酵和干燥时EGCG3″Me含量急剧降低，尤其是发酵和干燥工序后，是因为被发酵破坏的EGCG3″Me含量大于揉捻工序的增加量，因此甲基化EGCG则在酶作用下彻底氧化聚合[34]，其含量难以检测到。

EGCG3″Me含量在萎凋过程中显著增加，但在发酵过程中显著降低，与其他加工方式相比，绿茶、白茶、黄茶工艺更能保持鲜叶中EGCG3″Me含量。而在不同类型绿茶的加工中蒸青绿茶与晒青绿茶的加工方式较炒青与烘青更有利于保持茶叶中的EGCG3"Me[24]。因此为开发富含EGCG3″Me茶叶可采摘秋梢，于正午采摘，并按照不发酵的绿茶加工工艺中的蒸青与晒青工艺加工，且在加工前进行适度摊放（轻度萎凋）可以尽可能的保持鲜叶中甲基化EGCG的含量。

3 人工合成甲基化EGCG

由于天然的甲基化EGCG在茶叶中含量十分有限，目前甲基化EGCG的合成成为近几年相关研究的主要方向。甲基化修饰EGCG合成甲基化EGCG是一种O-甲基转移反应，合成甲基化EGCG主要有化学合成与酶合成两种方法[35]。

目前化学修饰合成甲基化EGCG主要有重氮甲烷合成法[36]、碘甲烷合成法[37-38]、硫酸二甲酯合成法[39-40]、硝基苯磺酰基保护基团合成法[41]与苄基保护基团合成法[42]；前三种方式合成反应为一步反应，对产率影响较小，但产物多为混合物，分离纯化过程繁琐，后两种方式虽为多步反应，但对苯环上酚羟基进行保护再通过氢化脱保护得到衍生物的方法使合成更加精细。

在酶法合成甲基化EGCG研究中，山本万里等[43]从日本高甲基化儿茶素的Benihomare茶叶中RNA、全长基因中分离得到了甲基化儿茶素合成酶基因，转入大肠杆菌进行表达诱导获得甲基化儿茶素合成酶，再以S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）作为甲基供体与EGCG进行酶促反应得到了5种甲基化EGCG。Kirita M等[44]从含有甲基化儿茶素的Benifuuki茶中分离出一种新型O-甲基转移酶基因，转入大肠杆菌诱导培养获得O-甲基转移酶，该酶液在Tris-HCl（pH 7.4）含有Mg2+的缓冲液中，催化EGCG和SAM进行酶促反应得到4种甲基化EGCG。费冬梅等[45]克隆EGCG-O-甲基转移酶（EGCG-O-methyltransferase，EOMT）基因，与大肠杆菌培养构建工程菌，以EGCG为底物进行诱导，通过调控诱导剂浓度、诱导时间、温度、底物浓度与培养基初始pH值等因素优化了诱导表达条件生成十种甲基化EGCG。吕海鹏等[46]对EGCG-O-甲基转移酶催化EGCG形成甲基化EGCG产物进行分析，生成十余种甲基化EGCG，但最主要的反应产物是EGCG3"Me。除了利用植物体内的甲基化酶基因之外，在动物与人体内甲基化转移酶对EGCG催化生成甲基化EGCG。Okushio K等[47]以SAM作为甲基供体在小鼠肝脏组织匀浆中，EGC，ECG和EGCG能够分别形成EGC4′Me，ECG4"Me和EGCG4"Me。LuH等[48]利用小鼠肝脏蛋白质催化EGCG形成EGCG4"Me，可再进一步形成EGCG4′4"-DiMe，或催化EGC形成EGC4′Me。Zhu BT等[49]利用人体胎盘包浆内的甲基转移酶对EC，ECG，EGC和EGCG进行酶促反应形成了多种甲基化EGCG。同时研究发现不同来源的O-甲基转移酶会造成反应产物的差异：植物类的植物类的O-甲基转移酶主要催化形成EGCG3"Me，而动物类的O-甲基转移酶主要催化形成EGCG4"Me[47-49]。

化学合成方法虽然目标性强、合成率高，但反应条件严苛，而且在反应过程中使用有机溶剂地残留会影响开发产品的安全性。而在酶合成方法中，虽然酶提取技术尚未成熟，但避免了使用有毒性的有机溶剂，且反应条件温和，相较化学合成方法，酶合成利于高安全性地合成与制备甲基化EGCG，是开发抗过敏型药物与保健品或功能性添加剂的较优途径。

4 甲基化EGCG的研究前景

近年来，花粉症已成为变态反应性疾病最常见的疾病之一。目前很多研究已经证实，甲基化EGCG在抗花粉过敏方面抑制效果较为显著。目前的治疗过敏性疾病的药物多为化学合成药，尚未发现有比茶叶中的EGCG3"Me和EGCG4"Me对抗过敏，尤其是抗花粉症过敏更显著的纯植物药品，因此，如果医学对甲基化EGCG的抗过敏效果进行进一步的验证，甲基化EGCG将会在未来被广泛应用于食品、医药等行业。

经过研究发现，虽然甲基化EGCG的抗过敏效果较为显著，但是其在茶叶中的含量有限。一方面，我们需要进一步对高甲基化EGCG功能性茶叶进行开发，因此寻找高含量甲基化EGCG的茶树种质资源是目前亟待解决的问题，由于高甲基化EGCG茶树种质资源存在区域性分布特征，即广东省与福建省拥有较多的高甲基化EGCG茶树品种，因此可以利用品种优势加以茶叶采摘及茶叶加工中可以良好保持甲基化EGCG含量的方式以提高成茶中甲基化EGCG含量。2005年富含甲基化儿茶素的茶种Benifuuki在日本已成功应用到预防过敏的功能性饮料中[50]，其可以有效缓解柳杉花粉过敏症，且不影响与季节性鼻炎者任何正常的免疫反应而广为日本消费者饮用。茶饮料作为保健型饮料是未来茶叶深加工产业的发展方向之一；另一方面，通过酶法合成甲基化EGCG为大量制备抗过敏型药物具有开发应用价值，将有利于更好地利用我国茶叶资源。