转基因大豆水酶法制油过程中内、外源基因的分布研究

张晓旭，陈复生，张丽芬，辛颖

（河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001）

大豆是我国的七大粮食作物之一[1]，也是世界上主要的油料作物之一，含有40%左右蛋白质，20%左右脂肪，其种植广泛，以美国的大豆产量列居全球之最[2]。近5年来，我国大豆的年产量在1 200万吨左右，但是年消费量达到了10 000万吨左右，对外依存度已高达80%左右，这些进口大豆多为美国、巴西和阿根廷的转基因大豆。

大豆油是转基因大豆的主要消费途径之一，压榨法、有机溶剂浸出法和水酶法是常用的提油方法，我国95%以上的大豆油都是使用有机溶剂浸出法提取[3]，最常见的有机溶剂是己烷，由于己烷在大豆油和空气中的残留会对人体及环境造成危害[4]，研究者开始探索高出油率的替代工艺，在众多潜在替代方案中，水酶法[5-6]已经得到了普遍关注。水酶法是在破碎大豆细胞壁的基础上，以水为介质，对脂蛋白、脂多糖进行降解，使油脂释放出来，其条件温和、工艺简单、耗能低，在无污染的前提下，可以同时提取油和蛋白质[7]。为了更大限度的提高大豆出油率，国内外学者对大豆的预处理方法进行了研究，发现挤压膨化预处理方式展现了明显的优势，大豆经挤压膨化后脂肪聚集并且充分暴露在表面[8-9]，蛋白质结构也由有序转变为无序，增加了蛋白对酶攻击的敏感性[10-11]，同时，减少了酶解后油与蛋白形成的乳状物[12-14]。

目前，关于转基因食品的安全性众说纷纭，人们依赖转基因大豆带来的益处的同时，也在尝试各种办法以最大限度的降解转基因大豆的外源基因，以降低转基因食品对人体的影响。王卫国等[15]探究微波处理和超高压处理对转基因大豆外源基因降解的影响，发现与超高压处理相比，微波处理对转基因大豆外源基因的降解更加明显。国内外对转基因食品的研究主要集中在转基因成分的检测及其食用或饲用安全性上[16-18]，而对转基因大豆制油过程中内、外源基因的降解状况鲜有报道。本课题通过数字PCR技术，探索经过挤压膨化后的转基因大豆提油过程中内、外源基因的降解变化规律，为我国转基因生物标识制度的监管提供有力的技术支持，同时，也为水酶法提取转基因大豆油安全性评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

转基因大豆：河南神农膨化饲料科技有限公司。

浓盐酸、氢氧化钠、乙醇、异丙醇、氯仿、异戊醇、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：均为分析纯，购自上海生工生物工程股份有限公司；碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L（2.4 AU/mL）：青岛吉宝中新国际贸易有限公司；RNA酶（Cat.#：2158）、Mix（RR901A）：宝生物工程（大连）有限公司；Tris-HCl：天根生化科技有限公司；十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）：河南工业大学粮油食品学院实验室自制；树脂型油类DNA提取试剂盒：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 仪器设备

数显pH计（PHS-3C）：上海仪电科学仪器股份有限公司；数显恒温水浴锅（HH-6）：常州普天仪器制造有限公司；多功能粉碎机（ST-07B）：上海树立仪器仪表有限公司；离心机（GL-10000C）：上海安亭科学仪器厂；PCR 仪（FFG02HSD）：Bio-Techne（TECH）公司；超微量蛋白核酸分析仪（BioDrop Duo 80-3006-61）：英国柏点公司；微滴制备仪（QX200）、PCR 仪（T100）、微滴分析仪（QX200 Droplet）：美国BIO-RAD公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

工艺流程见图1。

图1 工艺流程图Fig.1 Flow chart

1.3.2 原料预处理

将转基因大豆粉碎后，进行挤压膨化预处理，条件为：套筒温度70℃～120℃（四段温度）；物料水分含量15%；主轴转速375 r/min；蒸汽压力0.5 MPa；模孔孔径8 mm。

1.3.3 水酶法提取转基因大豆油的单因素试验

以油脂提取率为目标，通过单因素试验对酶解参数进行优化，研究酶解参数即料液比、加酶量、酶解时间、酶解温度和酶解pH值，设置4个因素不变，只改变1个因素，来确定各因素对油脂提取率的影响。各因素的范围如下：pH 8.0～10.5，加酶量1.4%～2.2%，酶解时间 2 h～4.5 h，酶解温度 40℃～65℃，料液比 1 ∶4（g/mL）～1 ∶8（g/mL）。

1.3.3.1 最适料液比的确定

取50 g挤压膨化过的转基因大豆粉（过80目筛）于锥形瓶中，加入料液比分别为 1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7、1∶8（g/mL）的蒸馏水，混匀，以1 mol/L的NaOH或HCl调整其pH值至9，加入2.0%的碱性蛋白酶，反应时间为4 h[16]，置50℃恒温水浴锅中反应，并用加速电动搅拌器不断搅拌，使pH值稳定在9不变。反应结束后，于95℃上加热10 min灭酶，5 000 r/min离心20 min。收集上层游离油放置在棕色玻璃瓶中，放入4℃冰箱内保存。通过提油率确定酶的最佳料液比，每个试验做3个平行。

1.3.3.2 最适加酶量的确定

按1.3.3.1中操作步骤，根据确定的最佳料液比，将加酶量分别设置为 0、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%。通过提油率确定最适加酶量。

1.3.3.3 最适酶解时间的确定

按1.3.3.1中操作步骤，根据确定的最佳料液比、加酶量，将反应时间分别设置为 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h。通过提油率确定酶的最佳酶解时间。

1.3.3.4 最适酶解温度的确定

按1.3.3.1中操作步骤，根据确定的最佳料液比、加酶量、酶解时间，将酶解温度分别设置为35、40、45、50、55℃。通过提油率确定酶的最佳酶解温度。

1.3.3.5 最适酶解pH值的确定

按1.3.3.1中操作步骤，根据确定的最佳料液比、加酶量、酶解时间、酶解温度，将酶解pH值分别设置为 8.5、9.0、9.5、10.0、10.5。通过提油率确定酶的最佳酶解pH值。

1.3.4 分析检测方法

1）水分的测定：参照GB/T 10362-2008《粮油检验玉米水分测定》。

2）粗脂肪的测定：参照NY/T 4-1982《谷类、油料作物种子粗脂肪测定方法》。

3）粗蛋白质的测定：参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

4）灰分的测定：参照GB 5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》。

5）转基因大豆提油率：

1.3.5 样品DNA的提取

挤压膨化后的转基因大豆、水酶法处理挤压膨化过的转基因大豆后得到的水相和渣采用SDS法[19]（水相取1 mL，不加SDS，其他步骤一样）提取DNA。

油相试剂盒严格按照说明书操作提取DNA。

1.3.6 引物及探针

数字PCR的引物及探针见表1。

表1 数字PCR的引物及探针Table 1 Primers and probes for digital PCR

1.3.7 数字PCR反应体系及程序

数字PCR的反应体系见表2，反应程序见表3。

表2 数字PCR的反应体系Table 2 Reaction system of digital PCR

表3 数字PCR的反应程序Table 3 Reaction procedure of digital PCR

1.3.8 数据处理

采用OriginPro 8.5软件对试验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 转基因大豆基本成分测定

转基因大豆的基本成分见表4。

表4 转基因大豆基本成分Table 4 Nutrient composition of genetically modified soybean

如表4所示，经过测定，转基因大豆的粗脂肪含量为21.013%左右，这与实际相符。除上述测定的成分之外，大豆还含有部分的碳水化合物以及微量元素等。

2.2 水酶法提取转基因大豆油单因素试验结果

各因素对转基因大豆提油率的影响结果见图2。

图2 各因素对转基因大豆提油率的影响Fig.2 Effect of various factors on oil extraction rate of genetically modified soybean

各因素对水酶法提取转基因大豆的提油率影响不同。由图2A所示，随着液体量增大，转基因大豆的提油率呈现先增大后减小的趋势，当料液比为1∶6（g/mL）时，提油率最大。这可能是由于水的加入，使蛋白质更大程度的溶出，从而酶解效率提高，提油率呈现增加的趋势；但是，加水量到一定程度后，溶液的整体浓度降低，酶与底物的浓度也降低，这使得酶分子与底物分子的碰撞几率减小，从而酶解效率降低，提油率呈现降低的趋势。图2B中，随着加酶量的增加，转基因大豆油的提油率呈现先增加后趋于稳定的趋势，当加酶量大于1.8%时，提油率开始稳定。这是由于加酶量的增加，有利于蛋白质的降解，从而使提油率增加；但当加酶量超过一定程度时，底物被酶饱和，再增加加酶量，对酶解效果影响不大，从而提油率趋于稳定。图2C中，随着酶解时间的延长，转基因大豆油的提油率呈现先显著增加，后趋于稳定的趋势。这是由于随着酶解时间的增加，酶解愈加彻底，所以提油率随之增加；但是当酶解时间达到4.0 h后，由于底物的减小，酶浓度的减小，抑制作用增加，这时再增加酶解时间，油脂也不再进一步释放，提油率趋于稳定。图2D中，随着酶解温度的提升，提油率呈现先增加后降低的趋势。这是由于温度升高，分子运动速度加快，酶分子与底物分子的碰撞几率增加，所以酶解效率增加，提油率随之增加；但是，当温度升到35℃时，酶会发生变性，其活性中心会部分或者完全丧失催化活性，这时，酶解效率就会下降，提油率也随之下降。图2E中，随着酶解pH值的增加，转基因大豆的提油率呈现先增加后减小的趋势。这是由于每一种酶都存在最适pH值的范围，当反应体系的pH值接近这个范围时，呈现的酶解效果最佳，从而提油率随之增加；但是，当反应体系的pH值超过9.0时，酶解效果就相对降低，从而提油率随之降低。因此提取的最佳工艺条件为：加酶量1.8%、酶解温度35℃、酶解时间4.0 h、酶解 pH9.0、料液比 1 ∶6（g/mL）。

2.3 DNA提取结果

样品DNA提取结果见表5。

表5 样品DNA提取结果Table 5 DNA extraction results of each sample

DNA的纯度主要取决于其在260 nm和280 nm处的吸光度，高质量DNA的A260/A280介于1.8～2.0之间，满足这一条件的DNA在进行定性PCR扩增的时候，才可以最大可能的排除假阴性结果。如表5所示，用核酸测定仪分别测定所提DNA的A260/A280，经过挤压膨化后的转基因大豆粉、水酶法反应后得到的水相、油相和渣的A260/A280都在1.8～2.0之间，这说明所提DNA适用于后续的PCR反应。

2.4 数字PCR检测结果

微滴式数字PCR仪测定各样品的Lectin基因图和EPSPS基因图见图3和图4，分析结果见表6。

图3 微滴式数字PCR仪测定各样品的lectin基因图Fig.3 Detection of lectin gene by digital PCR

图4 微滴式数字PCR测定各样品的EPSPS基因图Fig.4 Detection of EPSPS gene by digital PCR

1 g挤压膨化后的转基因大豆经过水酶法（按照单因素结果进行酶解）离心得到约4.1 g的水相、0.8 g的固相、0.1 g油相，由于0.1 g膨化后的转基因大豆、0.1 g水酶法得到的水相（密度为1.029 8 g/mL）以及0.1 g固相中所提的DNA体积为200 μL，水酶法得到的3 mL油相（密度为0.9010g/mL）中所提的DNA体积为20μL，以膨化过的转基因大豆为例：针对Lectin基因，1 μL DNA最终拷贝数为73 600，0.1 g膨化后的转基因大豆所提的DNA体积为200 μL，则0.1 g膨化后的转基因大豆含有的Lectin基因的最终拷贝数为147.2×105，那么1 g挤压膨化后的转基因大豆含有的Lectin基因的最终拷贝数为147.2×106，以此类推经过换算：1 g膨化后的转基因大豆含EPSPS基因的拷贝数为38×106；经过挤压膨化得到的4.1 g水相中Lectin基因的拷贝数为95.776×106，占总拷贝数的65.065 2%，EPSPS基因的拷贝数为31.062×106，占总拷贝数的81.742 1%；0.8 g固相中Lectin基因的拷贝数为24.832×106，占总拷贝数的16.892 5%，EPSPS基因的拷贝数为4.288×106，占总拷贝数的11.2 842%；0.1 g油相中Lectin基因的拷贝数为252，占总拷贝数的0.000 2%，EPSPS基因的拷贝数为139，占总拷贝数的0.000 4%。总体上，在水酶法提油过程中，无论是转基因大豆内源Lectin基因，还是外源EPSPS基因主要分布在水相中，这是由于DNA溶于水；其次分布于固相中，这是由于离心力的作用，使部分DNA沉淀于固相中，从而油相中DNA分布最少。转基因大豆内源Lectin基因与外源EPSPS基因相比，外源EPSPS基因更易溶于水相。水酶法所得的油相中外源EPSPS基因所占比例与内源Lectin基因所占比例相差不大，水酶法工艺过程并不能使所得油脂中的外源EPSPS基因降解完全，由此可知，尽管水酶法所得的油脂中DNA含量很低，但是外源EPSPS基因仍然存在。

表6 数字PCR分析结果Table 6 Results of digital PCR

总体而言，水酶法工艺过程过于温和，不能使转基因大豆的内、外源基因发生明显降解，但是由结果可知：水酶法提取得到水相中内、外源基因的含量最大，其次是固相中，大豆油中内、外源基因的含量微乎其微，但依然可以检出。同时，水酶法所得水相、固相、油相的内源Lectin基因拷贝数之和占总拷贝数的81.957 9%，其EPSPS基因拷贝数之和占总拷贝数的93.026 7%，使得水酶法得到的水相、固相和油相中的基因含量总和不足100%，这说明除去误差，也有部分内、外源基因发生了降解，但是总体而言，转基因大豆内源Lectin基因降解量大于外源EPSPS基因，由此可知，转基因大豆的外源EPSPS基因相比内源Lectin基因更加稳定，不易发生降解。

3 结论

大豆经挤压膨化后，其细胞壁得到充分的破坏，脂肪聚集并且充分暴露在表面，有利于水酶法对油脂进行提取。离心分离后，游离油与水相分界明显，可以直接对游离油进行收集，打破了常规以离心残渣中残油率为指标的提油率计算方法。

以挤压膨化过的转基因大豆粉为原料，以清油得率为指标，对酶解温度、时间、pH值、加酶量以及料液比进行优化，通过单因素试验，确定水酶法提取转基因大豆油的最佳工艺条件为：加酶量1.8%、酶解温度35℃、酶解时间4.0 h、酶解pH 9.0、料液比1∶6（g/mL）。

采用数字PCR对水酶法提取转基因大豆油得到的水相、固相和油相中内、外源基因进行测定，发现水酶法得到的水相中转基因大豆的内源基因占65.065 2%，外源基因占81.7421%；固相中内源基因占16.892 5%，外源基因占11.284 2%；油相中内源基因占0.000 2%，外源基因占0.000 4%。