p53基因第72密码子基因多态性与胃溃疡患者Hp易感性、预后的关系

郝欣，王荣升，李建辉

(承德市中心医院，河北承德067000)

幽门螺杆菌(Hp)具有高感染性，普通人群Hp感染率约为50%，是消化性溃疡、远端胃腺癌和胃淋巴瘤的主要病因[1，2]。研究显示，Hp可使活性氧过度积累从而导致组织细胞毒性损伤及再生障碍，促使胃部炎症反应持续存在和加剧；通过促进活性氧和氮的释放，Hp可使脆性组氨酸三联体表达下调和白细胞介素8表达上调，以促进胃癌的发生、发展[3]。但是以上具体致病机制尚未完全明确。近年来，与Hp易感性有关的人类基因研究逐渐成为热点。p53基因是重要的肿瘤抑制基因之一，是目前发现与人类肿瘤相关性较高的基因[4]。p53介导的细胞信号转导途径参与调节细胞周期、细胞死亡与凋亡，在调节细胞正常生命活动中起重要作用。但是p53基因突变后会失去对细胞生长、凋亡和DNA修复的调控作用，由抑癌基因转变为癌基因。p53基因失活突变与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[5]。本研究探讨Hp感染胃溃疡患者p53基因第72密码子基因多态性，进一步阐明Hp感染胃溃疡发病的遗传学机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年1月～2015年12月承德市中心医院消化内科诊断为Hp感染胃溃疡患者150例(观察组)，男89例、女61例，年龄(43.72±7.18)岁，病程(3.26±1.82)年；溃疡部位：胃窦71例、胃角44例、胃体19例、胃底16例。同时选择非Hp感染的150例胃溃疡患者作为对照组，男84例、女66例，年龄(45.29±8.25)岁，病程(3.33±2.16)年；溃疡部位：胃窦59例、胃角52例、胃体21例、胃底18例。两组年龄、性别、病程、溃疡部位等比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。胃溃疡以胃镜检查以及X线钡餐检查确诊。胃镜检查时取活检标本进行快速尿素酶试验和组织学检查，若两种检查结果均为阳性则判断为Hp感染阳性，若两种检查结果均为阴性则判断为Hp感染阴性。快速尿素酶试验和组织学检查结果不一致的患者不纳入研究。

1.2 Hp感染胃溃疡的治疗 Hp感染胃溃疡患者采用三联疗法联合胃黏膜保护剂进行治疗。三联疗法为埃索美拉唑20 mg+克拉霉素0.5 g+阿莫西林1.0 g，2次/d；胃黏膜保护剂为硫糖铝片1 g，4次/d。疗程为4周。停药1个月后复查胃镜，观察胃溃疡愈合情况及Hp根除情况。

1.3 p53基因第72密码子基因型检测 治疗前取EDTA抗凝管分别收集两组空腹外周静脉血5 mL，采用北京康为世纪生物技术有限公司的RNApure Blood Kit提取p53基因第72密码子DNA，以2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。采用美国Thermo 公司Nanodrop1000分光光度计检测DNA的纯度和浓度，-80 ℃保存备用。p53基因第72密码子DVA的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：上游5′-AGAGGAATCCCAAAGTTCCA-3′，下游5′-AGAGGAATCCCAAAGTTCCA-3′，其扩增产物大小为413 bp。PCR反应总体系为10 μL：2 × Taq Man Master Mix 5.0 μL，P53基因引物各0.45 μL，Taq Man FAM和HEX 探针各0.25 μL，模板DNA 2.0 μL及去离子水1.6 μL。采用ABI 9700 PCR 仪进行PCR反应，95 ℃预变性5 min，95 ℃变性0.5 min，58 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸0.5 min，进行40 个循环，最后72 ℃延伸6 min。以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并且以Gene Genius全自动凝胶成像系统(美国Syngene公司)进行分析。PCR产物采用限制性内切酶Bst UI进行酶切，60 ℃水浴过夜。酶切总体系如下：酶切 Buffer 2 μL，p53 PCR产物4 μL，酶0.5 μL，无酶水13.5 μL，共20 μL。酶切产物10 μL经2%琼脂糖电泳40 min，用Gene Genius全自动凝胶成像系统观察结果。根据电泳结果酶切产物分为Pro/Pro基因型、Arg/Arg基因型和Pro/Arg基因型。

1.4 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件。计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验；用Hardy-Weinberg检验进行基因型频率吻合度检测；用Logistic回归分析p53基因第72密码子基因多态性与Hp易感性的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p53基因第72密码子基因多态性 p53基因第72密码子基因PCR扩增产物在413 bp处出现目基因片段的电泳条带，见图1。PCR扩增产物经过Bst UI酶切后分别在160、253、413 bp处出现3种电泳条带，其中在413 bp处出现1条电泳条带的为Pro/Pro基因型，在253和160 bp处出现2条电泳条带的为Arg/Arg基因型，而在453、253和160 bp处出现3条电泳条带的为Pro/Arg基因型。见图2。

注：M为DNA Ladder；1为阴性对照；2～10为p53基因第72密码子基因PCR扩增产物。

图1p53基因第72密码子基因PCR扩增产物电泳图

注：M为DNA Ladder；1 为阴性对照；2、3、7为Pro/Pro基因型；5、6、10为Arg/Arg基因型；4、8、9为Pro/Arg基因型。

图2p53基因第72密码子基因PCR扩增产物酶切产物电泳图

2.2 两组p53基因第72密码子基因型表达及其与Hp感染的关系 两组p53基因第72密码子Pro/Pro、Arg/Arg和Pro/Arg基因型频率均符合Hardy-Weinber平衡定律(P>0.05)，说明各基因类型在两种人群中的分布符合遗传平衡，样本具有群体代表性。两组p53基因第72密码子基因型Pro/Pro、Arg/Arg和Pro/Arg分布频率比较差异具有统计学意义(P均<0.05)。见表1。多因素Logistic回归分析结果显示，与基因型为Arg/Arg和Pro/Arg比较，基因型Pro/Pro的胃溃疡患者幽门螺旋杆菌感染危险性升高(OR分别为0.586、0.512、1.000，P均<0.05)。

表1 两组p53基因第72密码子基因型比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 Hp感染胃溃疡患者p53基因第72密码子基因多态性与临床预后的关系 药物治疗4周后停药1个月时，观察组Hp根除率和溃疡愈合率分别为77.33%和83.33%。p53基因第72密码子不同基因型患者Hp根除率和溃疡愈合率差异具有统计意义(P均<0.05)。见表2。

表2 p53基因第72密码子不同基因型Hp感染胃溃疡患者Hp根除和溃疡愈合情况比较[例(%)]

3 讨论

p53基因位于人类17号染色体短臂上，编码一个相对分子质量为53 kD的核磷酸蛋白，具有转录因子的活性，在控制细胞周期、细胞凋亡以及DNA修复过程中发挥重要作用。p53基因是一种抑癌基因，p53介导细胞在DNA损伤后于G1期停滞进行切除和修复，以保持基因组的稳定性，是迄今为止发现的与人类肿瘤最密切相关的基因。目前已发现p53基因多态性至少为10种，多项研究显示位于第4外显子的p53基因第72密码子基因多态性与头颈肿瘤、肝肿瘤等多种恶性肿瘤的易感性密切相关[6,7]。p53也参与免疫和代谢系统的多种功能，影响干细胞生成[8]。有研究发现，p53组成的信号通路在胃黏膜损伤和修复过程中扮演着极为重要的角色。p53信号分子的异常表达，可造成黏膜细胞损伤，迁移受阻，凋亡加速，进而破坏胃黏膜防御屏障，导致胃黏膜损伤发生。编码p53基因第72位密码子的氨基酸包括Arg和Pro，含Arg/Arg和Pro/Pro两种基因类型的p53均为野生型，Arg/Pro为突变型。野生型和突变型的分子生物学行为和功能相差很大[9]。野生型p53具有负调节细胞生长的能力，可感知细胞基因组的完整性，修复损伤DNA，清除有癌变倾向的细胞，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡[10]。在野生型p53中，Arg较Pro有更强的诱导细胞凋亡能力[11]。p53一旦发生突变，则失去抑癌功能，并诱导正常细胞向癌细胞转化，同时突变型p53阻碍其他野生型p53发挥功能，最终促进肿瘤的发生、演进及转移[12]。有研究显示，p53基因第72密码子多态性可导致乳腺癌患者对化疗及内分泌治疗反应的不同，影响患者预后及生存[13]。

Hp是一种具有较高感染率的革兰阴性致病菌，寄生于胃黏膜，目前已知其与慢性胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤和胃癌的发生密切相关[14～18]。由Hp分泌的Cag A蛋白等毒性蛋白可激活核因子κB信号通路，诱导各种炎症介质生成增加，导致胃黏膜炎症、胃溃疡的产生，甚至诱发胃黏膜发生癌变[19]；对胃溃疡患者Hp易感基因的研究，可为建立胃癌高危人群预警和应用分子标志物早期诊断奠定基础。本研究显示，Hp感染阳性胃溃疡患者p53基因第72密码子基因型Pro/Pro、Arg/Arg、Pro/Arg与Hp感染阴性胃溃疡患者比较差异均具有统计学意义；与基因型为Arg/Arg和Pro/Arg的患者比较，基因型为Pro/Pro者Hp感染危险性升高，Hp根除率和胃溃疡愈合率降低。说明p53基因第72密码子基因型Pro/Pro可增加胃溃疡Hp感染的危险并影响患者预后。