SLE患者PBMC中lncRNA表达变化及意义

阿霄，袁李梅，曹文婷，邓丹琪

(1楚雄彝族自治州人民医院，云南楚雄675000；2昆明医科大学第二附属医院)

系统性红斑狼疮(SLE)是临床常见的典型的自身免疫性结缔组织病，可发生于任何年龄，但主要侵犯育龄期女性[1]，以多器官、多系统损害为特点。该病病程长，反复迁延，致残率高，对人体危害极大。目前对SLE的治疗并无完全有效的方法。研究提示体内B细胞产生过多抗体、炎症性T细胞浸润靶器官、免疫细胞异常活化参与SLE的发病[2,3]，但其确切发病机制尚不清楚。大量研究表明，SLE的发病具有遗传倾向，SLE的易患基因、易患位点及异常表观遗传调控在其发生发展中发挥重要作用[4～6]。微小RNA(miRNA)是近年来研究的方向。研究表明miRNA参与SLE的发病，如miRNA-125a参与调节SLE患者T细胞炎症趋化因子RNATES的表达[7]。长链非编码RNA(lncRNA)是继miRNA之后新的研究方向。有研究显示lncRNA和miRNA可相互影响，进而加速疾病进展[8]。近年来研究揭示，lncRNA在免疫系统中起着非常重要的作用，成为免疫学关注的焦点，lncRNA表达异常可以影响多种免疫系统疾病的发生、发展及预后[9,10]。研究lncRNA与SLE的关系可为进一步探讨SLE的发病机制及寻找治疗靶标提供理论基础。随着高通量测序技术(RNA-seq)的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数lncRNA的功能仍不清楚。目前已有有关miRNAs与SLE发病机制关系的研究，但对lncRNA与SLE关系的相关研究较少。本研究期望通过RNA-seq筛选SLE患者外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的lncRNA，并进一步探究lncRNA表达变化与SLE发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年5月～2018年5月昆明医科大学第二附属医院收治的SLE患者18例(SLE组)，均符合1997年美国风湿病协会SLE分类标准，均为女性，年龄21～54岁、平均39.5岁，病程1个月～10年，SLE疾病活动度指数(SLEDAI)评分为6～15分。随机选5例用于RNA-seq测序，其余13例根据入院24 h尿蛋白定量检测结果分为蛋白尿阳性组4例(24 h蛋白尿≥0.5 g)、蛋白尿阴性组9例(24 h蛋白尿<0.5 g)；根据补体C3水平分为低补体组7例(C3<0.79 g/L)、正常补体组6例(C30.79～1.52 g/L)。排除标准：合并严重感染、其他自身免疫性疾病及肿瘤。同期选取体检健康的女性志愿者作为健康对照组(NC组)，年龄19～55岁、平均37.5岁；均无严重感染、自身免疫性疾病、肿瘤等，且肝肾功能正常；随机选取5例用于RNA-seq测序。各组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经昆明医科大学第二附属医院伦理委员会批准，参与者知情同意。

1.2 PBMC提取 收集两组外周静脉血20 mL，置于EDTA抗凝管中，经红细胞裂解液裂解细胞后使用人外周血淋巴细胞分离液提取PBMC。

1.3 差异表达基因筛选 采用RNA-seq。SLE组、NC组分别取5例份PBMC，TRIzol法提取PBMC的总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，分光光度计检测RNA的浓度和纯度，将提取的总RNA送北京诺禾公司进行RNA-seq检测，根据检测结果分析两组差异表达的基因。筛选条件为差异倍数绝对值>1.2。

1.4 linc00861表达检测 采用qRT-PCR技术。SLE组、NC组分别取剩余的13例份PBMC，并提取总RNA，以RNA 2 μg为模板进行逆转录，逆转录体系：RT Primer Mix 1 μL、5×Reaction buffer 4 μL、RIbolock 0.5 μL、dNTP mixture 1 μL、Reverse Aid Enzyme 1 μL，Rnase Free DH2O Up to 20 μL。逆转录反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，4 ℃ 30 min。以cDNA为模板进行real-time PCR，反应体系：SYBR Premix Ex Taq TM 10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.8 μL、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL、cDNA溶液(模板)1.0 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、Rnase Free dH2O 7.0 μL。扩增条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。lnc00861-F：5′-TCCTGCTTTCACCCAGT-3′，lnc00861-R：5′-TAGTCCCAGGTCAGGATTGC-3′；GAPDH-F：5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′，GAPDH-R：5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′。GAPDH为内参。每个样本设3个副孔，副孔的循环阈值(Ct)差异控制在0.5个Ct以内。用2-△△Ct法计算目标基因相对表达量。

2 结果

2.1 SLE患者的差异表达基因 通过RNA-seq得到有63 677个ensembl gene ID的基因表达矩阵。将表达矩阵中值为0的基因删除，用DAVID将ensembl gene ID匹配到对应的gene symbol，得到11 044个有gene symbol的表达矩阵，有1 584个lncRNA，其中958个表达上调，626个表达下调。将该表达矩阵先进行对数转化，而后进行差异表达分析，筛选出特定的lncRNA进行进一步的实验。见表1，满足筛选条件的为linc00861。

表1 差异表达的lncRNA

2.2 SLE患者PBMC中linc00861表达变化 SLE组PBMC中linc00861相对表达量(0.52±0.13)低于NC组(1.62±0.90)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。SLE患者PBMC中linc00861相对表达量与SLEDAI评分呈负相关(r=-6.27，P<0.05)。蛋白尿阳性组PBMC中linc00861相对表达量(0.15±0.06)低于蛋白尿阴性组(0.53±0.14)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常补体组PBMC中linc00861相对表达量(0.54±0.11)高于低补体组(0.28±0.09)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

SLE是一种受多基因调控的复杂过程，越来越多的研究表明lncRNA在印记控制、细胞分化和免疫反应中起调节作用[11,12]。研究表明lncRNA与肿瘤和自身免疫性疾病存在相关性[13]。在各种免疫介导的疾病中，lncRNAs主要表达在患者的免疫细胞中[14]。在多种肿瘤组织中发现lncRNA异常表达，如lncRNA-UCA1在膀胱癌组织中特异性表达，且可作为膀胱癌早期筛查的指标[15]。检测SLE患者lncRNAs的表达变化，可为SLE发病机制的研究提供理论基础，还有可能发现早期诊断的标志物。RNA-seq的发展从根本上改变了对人类健康和疾病的遗传和表观遗传分子基础的理解。本研究通过RNA-seq筛选出SLE患者差异表达的linc0086。

本研究采用qRT-PCR技术进一步分析发现，与NC组相比，SLE组PBMC中linc00861低表达。Spurlock等[11]研究发现linc00861在Th1细胞中特异性过表达，且与未处理对照组相比经Th17细胞极化因子处理后的PBMC中linc00861表达下调[16]。IL-17及其相关辅助性T细胞亚群Th17在自身免疫性疾病(包括SLE)的病理生理过程中发挥重要作用[17,18]。多项独立研究已经证实，无论SLE为何种类型，SLE患者的IL-17A水平都较高[19,20]。研究发现，间充质干细胞可抑制SLE鼠模型外周血中Th17细胞分化，同时其血清中的自身抗体水平降低，进而改善了肾功能，延长了鼠的存活期[21,22]。有研究发现SLE患者和正常人在Th17通路中有部分基因表达有差异[23]，提示linc00861在该通路可能参与了SLE的发病过程，linc00861可能是SLE的一个治疗靶点。由于条件有限，本研究并未进行IL-17的相关实验。

本研究结果显示，SLE患者PBMC中linc00861的表达低于健康对照组。SLE是一种以皮肤病变为突出表现可累及全身的多系统疾病，肾脏受累是患者早期死亡的主要原因。研究发现接近60%的SLE患者进展为临床相关性肾炎[24]。肾功能的损害、持续性的蛋白尿是造成狼疮肾患者进展为慢性肾脏疾病甚至死亡的独立危险因素[25]，尿蛋白的检测、量化对于监测狼疮肾患者肾脏疾病活动性极为重要，同时也是早期发现肾脏损害情况及评估患者病情的重要检测方法。本研究发现，linc00861在蛋白尿阳性组的表达低于蛋白尿阴性组，提示linc00861在某种程度上可作为监测SLE患者肾脏损伤情况的指标。

SLE疾病活动时机体可产生大量的免疫复合物并沉积到各器官组织中导致补体系统被激活，在补体的参与下通过经典和旁路途径使免疫复合物被清除，进而导致血清中C3、C4大量消耗，并沉积在皮肤基底膜带。所以当SLE活动期机体血清中C3、C4水平明显降低[26]。SLE缓解期内机体免疫复合物产生相对减少，补体C3、C4无明显耗损。所以C3、C4可作为判断SLE疾病活动性的重要指标。研究发现与C4相比，C3在SLE疾病活动期降低更明显。因为C3可同时通过两条补体激活途径被消耗，但C4只能通过经典途径被消耗。所以在SLE疾病活动期C3降低更明显[27]。本研究发现，linc00861在低补体组中的表达明显低于正常补体组，进一步提示linc00861表达与SLE疾病的活动度密切相关。补体降低及SLEDAI评分是SLE疾病活动的重要标志。linc00861的表达与SLEDAI评分呈负相关关系。

综上所述，SLE患者PBMC中linc00861呈低表达，并与疾病活动及肾脏受累程度相关。提示linc00861可能参与SLE的发病，为寻找早期诊断标志物及药物与生物治疗靶点奠定基础。但由于本研究样本量较小，研究不够深入，尚需大样本多中心研究加以证实。