黄芪甲苷改善大鼠急性脑梗死神经运动功能及对梗死侧大脑皮层中NF-κB p65及IKKβ蛋白的影响*

付蓓蓓 郑永强 徐 悦

［湖北省十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院），湖北 十堰 442000］

急性脑梗死是由于脑部血液供应突然中断后导致脑组织缺血缺氧引起脑组织神经功能缺损的综合征。本病在中老年人群高发，是致死和致残的最主要原因，已排在我国死亡原因的第2位，致残原因的第1位。每年脑梗死治疗费用占到医疗健康预算的3%～7%［1-2］。随着人口老龄化进程的加速，其病死率、致残率和医疗花费都在增加。笔者在医院神经内科的临床工作中体会到，急性脑梗死的治疗主要是改善患者的活动能力和生活质量。因此，改善神经运动功能是急性脑梗死的治疗关键。现代药理学研究发现，黄芪具有抗炎、抗氧化、免疫调节、保肝等多种药用价值［3］。黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分，通过抑制缺血区苯二氮 受体的表达，减少半暗区面积，从而发挥保护脑组织的作用［4］。在发生急性脑梗死时，继发性颅内炎症级联反应是导致病情加重的一个重要因素［5］。 核转录因子-κB（NF-κB）信号通路是体内抗氧化系统中重要的通路，可调控下游的氧化应激和炎症反应等相关基因的转录［6］。因此，本研究通过制备大鼠急性脑梗死模型，给予不同剂量的黄芪甲苷进行干预，探讨黄芪甲苷改善大鼠急性脑梗死神经运动功能及其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取雄性8周龄SD大鼠40只［由山东省医学科学院实验动物中心提供，许可证号SCXK（鲁）2012-0002，动物合格证编号0001507］，体质量200～240 g，动物饲养在温度22～24℃，相对湿度为40%～70%，噪音≤50 dB的SPF环境中，自由进食和饮水，控制饲养环境昼夜循环（12h/12h）。动物相关处置均符合《中华人民共和国实验动物管理条例》要求，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 药物与试剂 黄芪甲苷（纯度98%，国药准字Z51020664，产品批号0781200008，购于上海融禾医药科技发展有限公司）；3%戊巴比妥 （购于上海上药新亚药业有限公司）；羟甲基纤维素钠（购于湖北远成赛创科技有限公司）；三苯基四氮唑（TTC）（购于美国Biosharp公司）；鼠抗 NF-κB p65 和 IΚB 激酶 β（IKKβ）抗体（购于美国Cell Signaling Technology公司）；鼠抗GADPH单克隆抗体和辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG二抗 （购于北京中杉金桥生物技术有限公司）；蛋白抽提试剂盒（购于武汉博士德生物工程有限公司）；ELISA试剂盒 （购于欣博盛生物科技有限公司）。因黄芪甲苷难溶于水，用0.5%羟甲基纤维素钠溶液溶解，配制成质量浓度为80 mg/kg的黄芪甲苷应用液备用。

1.3 分组及造模 对SD大鼠进行编号，用随机数字表法将SD大鼠均分为4组：假手术组、模型组、溶剂对照组和黄芪甲苷组。大鼠禁食12 h后用3%戊巴比妥（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，对颈部进行剃毛和消毒，使大鼠仰卧固定于手术台上，沿颈正中线行手术切口，进行肌肉钝性分离，充分暴露右侧血管，分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉，在距颈内和颈外动脉分叉处约4 mm剪开一个小口，将预先浸在肝素溶液中的尼龙鱼线从开口插入颈内动脉20 mm，阻塞大脑血流［7］。用生理盐水清洗切口后逐层缝合。假手术组只切开皮肤和分离血管，不阻塞血流。术后给予20万U青霉素肌肉注射，连续使用3 d。黄芪甲苷组腹腔注射给予80 mg/kg的黄芪甲苷应用液，从术后第1日开始，持续给予14 d。假手术组和模型组给予等体积0.9%氯化钠注射液，溶剂对照组给予等体积0.5%羟甲基纤维素钠溶液。在第14日对大鼠神经运动功能评分后处死大鼠，分离脑组织进行相关检测。

1.4 标本采集与检测 1）TTC染色测定大鼠脑梗死体积。处死大鼠后取完整脑组织，每组3个脑组织置于冰箱中冷冻15 min，行冠状位切片，厚度2 mm，置于2%的TTC染液中孵育30 min，用磷酸盐缓冲液终止染色。用4%的甲醛固定2 h后拍照，用Image Pro Plus 6.0软件计算梗死体积。2）神经运动功能评分。根据Bederson JB评分方法进行评分，采用双盲法，于造模后1 d和14 d各评1次。3）ELISA法检测梗死侧大脑皮层中白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量。取适量右侧脑组织，制成匀浆，吸取上清进行实验。根据ELISA试剂盒说明书进行IL-1β和TNF-α含量测定，在450 nm处测各孔吸光度（A）值。4）Western blotting法检测梗死侧大脑皮层组织中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平。取适量右侧脑组织，约50 mg，用预冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，按1∶9加入蛋白抽提试剂，用超声进行破碎，裂解15 min后离心后取上清，进行蛋白含量测定后调整蛋白质量浓度至10 mg/mL，加入1/5体积的5×Buffer进行变性，-80℃保存。对标本进行电泳、切胶；孵育一抗、孵育二抗，用凝胶成像系统采集图像并进行分析。

1.5 统计学处理 应用IBM SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析进行判断，组间两两比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各种大鼠脑梗死体积比较 见表1，图1。假手术组未见梗死灶，其余各组均出现不同程度梗死。溶剂对照组与模型组比较，梗死体积无明显减小，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组和溶剂对照组比较，黄芪甲苷组梗死体积明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠脑梗死体积比较（%，±s）

表1 各组大鼠脑梗死体积比较（%，±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，△P＜0.05；与溶剂对照组比较，▲P＜0.05。 下同

组 别 n 大鼠脑梗死体积假手术组 3模型组 3溶剂对照组 3 0 25.13±5.06△24.90±4.93*黄芪甲苷组 313.85±3.64*▲

图1 各种大鼠脑梗死体积比较

2.2 各组大鼠神经运动功能评分比较 见表2。造模后直至实验结束，假手术组未见大鼠死亡，模型组、溶剂对照组和黄芪甲苷组大鼠分别死亡2只、3只和1只。造模后1 d，各组大鼠神经运动功能评分无显著差异（P＞0.05）；14 d后，溶剂对照组与模型组比较，大鼠神经运动功能评分无明显差异（P＞0.05）；与模型组和溶剂对照组比较，黄芪甲苷组大鼠神经运动功能评分明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠神经运动功能评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠神经运动功能评分比较（分，±s）

组 别 n 1 d 14 d假手术组 10模型组 8溶剂对照组 7 0 0 2.93±0.36△ 2.26±0.29△2.90±0.42 2.35±0.36*黄芪甲苷组 92.85±0.44 1.48±0.20*▲

2.3 各组大鼠梗死侧大脑皮层中IL-1β和TNF-α含量比较 见表3。与假手术组比较，各组梗死侧大脑皮层中IL-1β和TNF-α含量均增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，溶剂对照组梗死侧大脑皮层中IL-1β和TNF-α含量降低不显著，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组和溶剂对照组比较，黄芪甲苷组梗死侧大脑皮层中IL-1β和TNF-α含量降低显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组大鼠梗死侧大脑皮层中IL-1β和TNF-α含量比较（ng/L，±s）

表3 各组大鼠梗死侧大脑皮层中IL-1β和TNF-α含量比较（ng/L，±s）

组 别 n IL-1β TNF-α假手术组 7模型组 5溶剂对照组 4 23.94±5.57 146.82±12.37 75.79±10.30△ 394.52±46.62△71.03±8.82△ 373.40±47.49△黄芪甲苷组 632.74±4.16*△▲ 213.73±33.06*△▲

2.4 各组大鼠梗死侧大脑皮层中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平比较 见表4，图2。与假手术组比较，各组梗死侧大脑皮层中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平均增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组和溶剂对照组比较，溶剂对照组梗死侧大脑皮层中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平降低不显著，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组和溶剂对照组比较，黄芪甲苷组梗死侧大脑皮层中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平降低显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表4 各组大鼠梗死侧大脑皮层中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平比较（±s）

表4 各组大鼠梗死侧大脑皮层中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平比较（±s）

组 别 n NF-κB p65 IKKβ假手术组 7模型组 5溶剂对照组 4 0.16±0.02 0.12±0.03 0.74±0.09△ 0.61±0.08△0.79±0.12△ 0.64±0.07△黄芪甲苷组 60.37±0.06*△▲ 0.29±0.05*△▲

图2 各组大鼠梗死侧大脑皮层中NF-κB p65和IKKβ蛋白表达

3 讨 论

目前，对急性脑梗死的治疗原则是恢复梗死区脑组织的血液灌流，保护依然存活的脑组织，减轻继发性的脑损伤。组织型凝血酶原激活物（tPA）是唯一通过食品药品监督管理局（FDA）许可的治疗急性脑梗死的药物，但因其治疗时间窗只有3 h，影响了临床使用率［8］。溶栓后对脑组织的保护是急性脑梗死治疗的核心，在脑缺血和再灌注后结构及功能破坏是引起脑梗死并发症的重要原因。同时，抑制炎症级联反应能显著降低其并发症［9］。糖皮质激素类药物是脑梗死后期脑保护治疗的一线药物，但其增加感染风险、消化系统溃疡等副作用限制了其临床应用［10］。同时，诸如心房肽、钙调蛋白拮抗剂等目前开发的新药尚未进入临床［11-12］。《神农本草经》记载，黄芪有利水消肿、益气理虚、扶正固本等功效。黄芪甲苷是衡量黄芪有效成分含量的一个重要的单体指标，其具有良好的有抗炎、抗氧化功能［13］。本研究结果显示，给予黄芪甲苷后，大鼠脑梗死体积显著减小、神经运动功能评分显著下降，提示黄芪甲苷能减小急性脑梗死大鼠的梗死体积和改善神经运动功能。

炎症反应的基础是炎症细胞和炎症介质，最终由炎症介质发挥作用。IL-1β是体内作用最强的炎症因子，是TNF-α级联反应的产物，TNF-α是炎症后最早出现的细胞因子，当他们过度表达时介导炎症因子趋化作用而加剧瀑布样炎症反应，最终导致组织损伤［14-15］。NF-κB通路参与了急性缺血性损伤的病理生理过程。其家族包含 RelA （p65）、NF-κBI、RelB、NF-κB2 和 c-Rel 5个成员，通过经典和非经典两种途径来发挥炎症反应调控作用［16］。其中经典途径主要与炎症反应有关，依赖于 IKKβ 水平的变化［17］。 静息状态下，NF-κB 处于低表达水平，与NF-κB的抑制因子（I-κB）结合形成非活性的二聚体。当发生缺血损伤时，在炎症介质 （如ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 等）的刺激下，通过细胞膜上的Toll样受体4（TLR-4）特异性识别炎症信号，使IKKβ表达水平增加，磷酸化I-κB并将其水解，识别 NF-κB p65，使 NF-κB p65 得到释放，从细胞质向细胞核转移，导致炎症反应的级联放大效应［18-19］。研究显示，香芹酚能通过抑制炎症介质（TNF-α和IL-1β）的表达来调控NF-κB p65和IKKβ的表达水平来发挥保护大鼠急性脑梗死后神经运动功能［20］。本研究结果与之相符。

综上所述，黄芪甲苷能改善急性脑梗死大鼠的神经运动功能，在脑梗死早期给予黄芪甲苷，能显著降低炎症因子（IL-1β和TNF-α等）的表达水平，从而抑制NF-κB信号通路来达到改善脑梗死预后的目的。本研究对黄芪甲苷治疗脑梗死患者预后提供了实验依据，黄芪甲苷药用价值的开发需进一步研究。