蛇床子素通过PI3K-AKT信号通路诱导HaCaT细胞凋亡的研究*

胡惠清 李 静 方 坤 卢彩红 吕保先 龙剑文

（1.湖北省武汉市第九医院，湖北 武汉 438000；2.湖北中医药大学第一临床学院，湖北 武汉430061）

银屑病是一种复杂的炎症性皮肤病，其中涉及到炎症细胞，角质形成细胞，血管内皮细胞之间复杂的相互作用［1］。银屑病皮损中角质形成细胞存在过度增殖和角化不全等现象，是一种表现为表皮动力学紊乱为特征的慢性炎症［2］。人磷酸化磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）通路信号转导通路对于细胞的增殖和抗凋亡起着至关重要的作用［3-4］。既往的研究表明PI3K-AKT通路在银屑病角质形成细胞的异常增殖中发挥重要作用，异常的角质形成细胞在一系列内外因素的作用下，通过启动PI3K-AKT信号转导通路，诱导细胞的过度增殖，避免细胞发生凋亡，对维持细胞高增殖的生物学特性发挥了重要作用［5］。蛇床子素是中药蛇床子的主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、解痉、降血压、增强免疫功能及广谱抗菌作用等［6］。本研究通过体外细胞培养的方法，研究了不同浓度蛇床子素对人永生化角质形成细胞株 （HaCaT细胞）细胞增殖和凋亡的影响以及对PI3K-AKT通路的调控和下游凋亡相关蛋白表达的影响。结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

蛇床子素粉剂购于美国Sigma公司。HaCaT细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 试剂和仪器

100 U/L青霉素，100 mg/L链霉素购自武汉博士德生物公司；DMEM干粉、小牛血清和胰蛋白酶购自GIBCO公司，CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物公司。分光光度仪为芬兰雷勃公司产品 （Multiskan MS，Labsystems Oy，Helsinki， Finland）； 细胞培养箱 （美国热电，3111型）。二甲基亚砜（DMSO，沈阳化学试剂厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 将HaCaT细胞培养于含10%小牛血清、100 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，37℃，5%CO2的细胞培养箱内培养。

1.3.2 CCK-8法检测细胞增殖的试验 将培养的HaCaT细胞，以5×104/孔接种于96孔板，每孔接种100 μL，培养液为含有10%小牛血清的DMEM，待细胞长至60%～70%融合状态时，加以处理因素，根据预实验结果分组为：60 μg/mL 蛇床子素处理组，40 μg/mL蛇床子素处理组，20 μg/mL蛇床子素处理组和正常对照组，每组均设6个平行孔，实验均重复3次，常规培养48 h。各处理组待测样品用DMSO溶解，用DMEM培养液稀释，DMSO终体积分数≤0.1%，每组蛇床子素终质量浓度分别为60、40、20 μg/mL。正常对照组每孔加入与处理组等体积的DMEM培养液，培养48 h，各组加入CCK-8 10 μL，待培养液显色后，用酶标仪测各孔450 nm波长的吸光度A值，以细胞的存活率表示细胞的增殖程度。细胞的存活率（%）=［（A1-A3）÷（A2-A3）］ × 100%。 A1：试验组；A2：对照组；A3：只含有培养基和CCK-8的空白组。

1.3.3 细胞凋亡检测 HaCaT细胞培养，分组同“1.3.1”项下方法。各组HaCaT细胞处理后，消化，洗涤，收集细胞，制备细胞悬液，冰浴避光中操作如下：采用结合缓冲液悬浮细胞，使其浓度为5×104/mL，后加入Annexin-FITC和PI，共同孵育15 min染色，1 h内，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.3.4 Hoechst33258荧光法观察细胞凋亡形态 取对数期细胞消化制备活细胞悬液，按每孔5×104/L接种于预先置入玻璃盖玻片的6孔培养板中，每孔加细胞悬液2 mL，培养24 h，试验分组和处理同“1.3.1”项下方法，孵育48 h后，吸尽培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，每孔加入4%多聚甲醛溶液固定，PBS洗涤细胞，Hoechst 33258染色，于荧光显微镜下观察细胞形态。

1.3.5 Western blotting检测 实验分组和处理同“1.3.1”项下方法，每个浓度均设6孔，培养48 h，收集培养后的HaCaT细胞，提取总蛋白，用BCA法蛋白定量，上样，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，PBS洗膜，5%脱脂牛奶封闭1 h；PBS洗膜后加一抗，多克隆兔抗PI3K（1∶1 500，Cell Signaling Technology，Inc，#4255）； 多克隆兔抗 p-PI3K （tyr458，1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#4228S）；多克隆兔抗 AKT（1∶1 1000，Cell Signaling Technology，Inc，#9272）； 多克隆兔抗 p-AKT（ser473，1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#4060）；单克隆兔抗 Bcl-2（1∶1000，CellSignalingTechnology，Inc，#4223）；单克隆兔抗 Bax （1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#5023）， 单克隆兔抗 Cleaved-caspase3 （1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#9664），4 ℃ 过 夜 ；PBS洗膜，用辣根过氧化物酶标记的二抗（上海兴悠生物科技有限公司）1∶5 000稀释后孵育0.5 h；洗膜后用增强化学发光试剂盒检测 （ECL，Amersham Biosciences公司）。结果扫描后，用Quantity one图像分析软件进行光密度分析，以 β-actin（Santa Cruz，1∶200）为内参校正。

1.4 统计学处理

应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，两个独立样本均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，多个样本均数的两两比较采用SNK-q法进行处理。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同质量浓度蛇床子素对HaCaT细胞增殖作用的影响

在所选质量浓度范围内，蛇床子素对HaCaT细胞的增殖有抑制作用（图1C）。不同质量浓度药物处理组分别培养 48 h 后，60 μg/mL 组、40 μg/mL 组、20 μg/mL组与正常对照组比较，HaCaT细胞增殖有显著差异（P＜0.05），且3个处理组组间比较，HaCaT细胞增殖也有显著差异（P＜0.05）。以上结果表明蛇床子素能质量浓度依赖性地抑制HaCaT细胞增殖。

2.2 不同质量浓度蛇床子素对HaCaT细胞凋亡的影响

AnnexinV/PI双 染 法 结 果 显 示 ，60 μg/mL 组 、40 μg/mL 组、20 μg/mL 组HaCaT 细胞凋亡较正常对照组显著增加（P＜0.05）；且3个处理组组间比较，Ha-CaT细胞凋亡也有显著差异（P＜0.05）。由此可见，蛇床子素对HaCaT细胞凋亡有促进作用。见图1A和1D。

2.3 各组HaCaT细胞凋亡形态比较

经Hoechst染色后，正常对照组中的HaCaT细胞大而饱满，呈均匀蓝色荧光；在不同质量浓度蛇床子素处理组中细胞核可见浓染致密的颗粒荧光，细胞缩小；随蛇床子素质量浓度的增加，细胞出现典型的凋亡形态，高倍镜下可观察到细胞变小，胞核皱缩、碎裂，染色质浓缩，聚集在核膜边缘，形成染色质边集。见图1B。

图1 各组HaCaT细胞增殖和凋亡比较

2.4 不同质量浓度蛇床子素对HaCaT细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2，Bax，Cleaved-caspase3 表达的影响

蛇床子素对HaCaT细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有抑制作用，对促凋亡蛋白Bax，Cleaved-caspase3的表达有促进作用（图2A和2B）。与正常对照组比较，蛇床子素 60 μg/mL 组、40 μg/mL 组、20 μg/mL 组对HaCaT细胞Bcl-2表达有抑制作用（P＜0.05），且各处理组间对HaCaT细胞Bcl-2表达抑制作用有显著性差异（均P＜0.05）。与正常对照组比较，蛇床子素60 μg/mL组、40 μg/mL 组、20 μg/mL 组对 HaCaT 细胞 Bax表达有促进作用 （P＜0.05），且各处理组间对HaCaT细胞Bax表达蛋白的促进作用有显著差异（均P＜0.05）。与正常对照组比较， 蛇床子素 60 μg/mL组、40 μg/mL组、20 μg/mL组对HaCaT细胞Cleaved-caspase3表达有促进作用 （P＜0.05），且各处理组间对HaCaT细胞Cleaved-caspase3表达蛋白的促进作用有显著性差异（均P＜0.05）。

图2 不同质量浓度蛇床子素对HaCaT细胞PI3K-AKT通路及下游凋亡相关蛋白表达的影响

2.5 不同质量浓度蛇床子素对HaCaT细胞AKT，p-AKT，PI3K，p-PI3K 表达的影响

蛇床子素处理对 HaCaT细胞 AKT，PI3K蛋白表达无明显影响，但对p-AKT，p-PI3K的表达有明显抑制作用（图2C和2D）。与正常对照组比较，蛇床子素60 μg/mL组、40 μg/mL 组、20 μg/mL 组对 HaCaT 细胞p-PI3K表达均有抑制作用（P＜0.05），且各处理组间对HaCaT细胞表达p-PI3K抑制作用有显著性差异 （均P＜0.05）。与正常对照组比较，蛇床子素60 μg/mL组、40 μg/mL 组、20 μg/mL 组对 HaCaT 细胞 p-AKT 表达均有抑制作用（P＜0.05），且各处理组间对HaCaT细胞p-AKT表达抑制作用有显著性差异（均P＜0.05）。与正常对照组比较，蛇床子素60 μg/mL组、40 μg/mL组、20 μg/mL组对HaCaT细胞AKT和PI3K蛋白表达无显著性差异（均P＞0.05）。

3 讨 论

角质形成细胞的过度增殖是寻常型银屑病的主要病理特征之一。现代研究表明磷脂酰肌醇3激酶信号转导通路即PI3K/AKT信号转导通路是细胞存活的重要通路［7］，广泛参与细胞增殖、细胞分化、细胞代谢和肿瘤侵袭等多个生物学过程，在维持细胞生长、增殖中发挥关键作用［8-10］。Akt是PI3K信号通路下游直接的靶蛋白，也称为蛋白激酶B（PKB），是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶［11］，有研究发现，银屑病皮损中PI3K基因及其亚单位PI3K蛋白的表达特异性增高［12］。也有研究表明银屑病患者皮损内p-Akt的蛋白水平明显高于正常皮肤［13］，Akt活性增强可引起角质细胞的过度增殖和真皮乳头血管增生［14］。而且AKT的活化可以调控下游Bax、Bcl-2的表达和功能，从而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖［15］。

在以前的研究中，蛇床子素能抑制部分肿瘤细胞的增殖［16］，前期研究也发现蛇床子素能抑制HaCaT细胞增殖［17］。但具体机制尚不清楚。在本研究中，笔者观察了不同质量浓度蛇床子素对HaCaT细胞增殖和凋亡的影响，并对PI3K-AKT通路和相关的下游蛋白进行了检测。结果表明，蛇床子素能抑制HaCaT细胞增殖和促进HaCaT细胞凋亡，此外，笔者还发现蛇床子素能抑制PI3K和AKT蛋白的磷酸化，并上调促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。根据上述结果，笔者认为蛇床子素可能通过抑制PI3K-AKT通路的活化，进而上调促凋亡蛋白的表达，下调抗凋亡蛋白的表达，抑制HaCaT细胞增殖和促进HaCaT细胞凋亡。尽管HaCaT细胞并不完全等同于银屑病皮损区角质形成细胞，但是在银屑病中，蛇床子素仍然有可能产生类似的效应。本研究为中药蛇床子治疗银屑病提供了一定的依据。