双参通脉颗粒对急性心肌缺血再灌注后的大鼠心肌细胞保护作用的影响*

吴 迪 刘 彤 杨 莺△

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

急性心肌梗死（AMI）是一类非常严重的缺血性心脏病，主要指由冠状动脉急性、持续性缺血缺氧引起的心肌坏死。AMI有起病急，致死致残率高等特点，已成为威胁人类健康的重要原因［1］。目前，缺血性心脏病的发病率呈逐年上升趋势，缺血性心血管病占我国心血管病总发病数的65%［2］。而心梗后心肌在得到再灌注的同时也伴随着一系列的心脏和血管的不良事件，如心律失常、心肌收缩功能障碍、甚至无复流等影响心肌缺血预后的事件［3］。心肌梗死在中医学属“胸痹”“心痛”范畴，中医学认为心肌梗死病机属本虚标实，本虚以气阴亏虚为主，不荣则痛；标实则是血瘀痰饮痹阻脉络，不通则痛。而双参通脉颗粒在养阴通脉治法的指导下对急性心肌梗死起到治疗作用。研究表明，炎症反应是造成心肌缺血再灌注损伤的重要原因之一［4-5］。血管细胞黏附分子 （VCAM-1）是组织炎性反应的主要因子，在炎症发生过程中发挥重要作用，与心脑血管疾病有密切关系［6］。 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与心肌缺血再灌注损伤具有密切相关性［7］，TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞产生，并与多种心脏疾病，如心力衰竭、缺血性心肌病等有关的一种炎性因子，而炎症反应可进一步加重心肌缺血损伤，也是心肌缺血再灌的主要病理机制之一［8］。本实验通过观察心肌组织中 VCAM-1、TNF-α的表达情况及光镜（HE染色）下观察心肌组织的病理改变来间接判断基于养阴通脉法指导下的双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注损伤心肌的治疗效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠，10～12周龄，雄性，体质量 250～280 g，共 40只，动物许可证号 SYXK（辽）2016-0063，自由饮水，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。

1.2 试药与仪器 1）药物：双参通脉颗粒（辽宁中医药大学附属医院心内科，批号20160531），由人参、丹参、黄芪、麦冬、川芎、当归6味药组成；西药合心爽（天津田边制药有限公司，批号1411087）；麻醉药水合氯醛（上海化学试剂有限公司，批号20130413，20131127）现用现配；2）试剂：VCAM-1、TNF-α酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测试剂盒（美国凯基生物有限公司，批号分别为 141425、141306）。3）仪器：DMS300Leica 图像分析仪 （德国Leica公司）；HL-B6型小动物呼吸机（北京新利科技有限公司）；CA52-3型全自动生化分析仪（长沙湘江仪器公司）；5234R型高速离心机（德国Eppdendorf公司）；OM3123型冰冻切片机（瑞典Bio公司）；恒温恒湿箱（上海科技生物公司）。

1.3 分组和造模［9］健康SD大鼠40只，随机分为对照组、模型组、中药组、西药组，每组10只。对模型组、中药组、西药组动物进行造模，复制急性心肌缺血再灌注模型。取大鼠称质量，采用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g，腹腔麻醉后固定于手术台上，记录结扎前5 minⅡ导联心电图，然后剪毛、消毒、铺巾，无菌下常规切开胸骨、心包、暴露出心脏，并于左冠状动脉前降支起始下2 mm处结扎，可见左心室前壁光泽度降低，并变苍白无血色，大鼠心脏搏动减弱，记录结扎后5 min、30 min和2 h的心电图，采用多导生理记录仪监测显示心电图标准Ⅱ导联，ST段抬高和（或）T波抬高（图1：造模前后Ⅱ导联心电图变化）。将以上标志作为急性心肌梗死建模成功的标志。结扎持续30 min后，打开结扎线。不结扎正常对照组，检查无出血后，将胸腔逐层关闭。

图1 造模前后Ⅱ导联心电图变化

1.4 干预方法 空白对照组与模型组，用生理盐水3 mL/kg进行连续灌胃2周，每日1次。中药组予双参通脉颗粒剂，用生理盐水制成3 mL/kg的混合液，相当于生药量11 g/kg。西药组予合心爽用生理盐水制成3 mL/kg混合液，质量浓度4.23 mg/kg。各组连续灌胃2周，每日1次。

1.5 标本采集与检测 1）心肌组织病理检测。2周后，实验动物麻醉后，打开胸腔，摘取心脏，置于无菌的生理盐水中，立即取下1 mm3的缺血心肌组织数块，分别置于10%的甲醛液中固定进行TUNEL，-80℃冰箱中冷藏用作光镜下病理检测。2）血清中VCAM-1检测。造模成功后，开腹并暴露腹主动脉，经腹主动脉采血5mL，低温离心后取上层血清，试管编号，相关步骤严格按照酶联免疫试剂盒要求进行测定，并计算出各样本血清浓度。3）血清TNF-α含量检测。经腹主动脉负压采血5 mL左右，低温离心取上层血清，试管编号后，ELISA法检测血清TNF-α含量，按试剂盒说明书进行测定：将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，5%小牛血清置37℃封闭40 min，洗涤液满孔洗涤3遍，每遍30 min，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，37 ℃，40～60 min，加入酶标抗体，37 ℃，30～60 min，加入底物液，37℃避光放置3～5 min，加入终止液显色，25 min内测定。

1.6 统计学处理 应用SPSS for Windows软件包进行方差分析、q检验等统计学分析处理，计量资料以（±s）表示。组间比较均采用多重比较SNK-q方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 光镜下大鼠心肌组织病理改变 见图2。心肌组织切片HE染色，可见空白对照组心肌组织无明显变性、坏死，心肌纤维排列较规则，染色均匀，横纹清晰，组织间隙水肿较轻，仅有轻度淤血等改变；模型组有部分心肌局灶性坏死，心肌纤维断裂，染色疏松，细胞及组织间隙水肿明显，心肌间质有出血，炎细胞浸润；中药组及西药组示心肌纤维较模型组排列规整、断裂较少，组织间隙水肿较轻，心肌间质轻度出血。

图2 各组心肌细胞病理改变（HE染色，200倍）

图3 各组心肌细胞VCAM-1表达

2.2 各组大鼠血清VCAM-1心肌组织中的表达比较见图3，表1。对照组中VCAM-1在心肌血管内皮细胞呈微弱的阳性表达，中药组和西药组中，有少量VCAM-1在心肌细胞间质和血管内皮细胞呈阳性表达，模型组可见VCAM-1在心肌细胞间质和血管内皮细胞中呈强阳性表达，阳性反应产物呈棕黄色，且强度增强和范围扩大。

表1 各组大鼠血清VCAM-1含量比较（±s）

表1 各组大鼠血清VCAM-1含量比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与中药组比较，△P＜0.05。 下同

组 别 n 面积 灰度对照组 10 7209.50±1611.79 2773.30±695.35模型组 10 45081.60±4222.11*△ 19762.39±11840.51*中药组 10 15251.10±1814.35*# 6412.99±1814.35*#西药组 10 21686.00±1965.96*#△ 8992.41±623.12*#△

2.3 各组大鼠血清TNF-α心肌组织中的表达比较见表2。结果显示，模型组与对照组相比TNF-α的表达程度明显升高，中药组和西药组中TNF-α的表达程度较低。

表2 各组大鼠血清TNF-α含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清TNF-α含量比较（±s）

组 别 n 面积 灰度对照组 10 7698.40±1023.52 3185.48±372.71模型组 10 52617.90±13586.60* 21674.45±3974.23*中药组 10 13829.60±3252.91*# 5687.64±1002.32*#西药组 10 19574.50±4719.00*#△ 8607.63±2563.20*#△

3 讨 论

本研究采用大鼠急性心肌梗死模型，通过比较大鼠心肌组织病理变化及各组间心肌组织 VCAM-1及TNF-α的表达情况，分析了基于益气养阴法指导下的双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注后大鼠心肌组织的氧化损伤的影响。本实验结果显示西药组和中药组VCAM-1和TNF-α的表达与模型组相比有明显下降（P＜0.05）。说明双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注后的心肌组织具有一定的保护作用。且现代药理研究已证实中医药对减轻炎症反应、改善心肌组织损伤等多个方面均具有效果［9-10］，药物对缺血再灌注损伤的防治作用以其有效及可控性好等优势得到研究者的广泛重视［11］。 中医学认为，心肌梗死属“胸痹”范畴，张仲景在《金匮要略》中提到“夫脉，当取太过不及。阳微阴弦，即胸痹而痛”。所以胸痹病机为本虚标实：其中本虚则以气虚、阴伤为主，气虚无力行血，阴伤即津液、精血亏虚，不足以濡养心神，气阴双亏，使心脉失养，不荣则痛。标实主要以痰瘀互结为主，气为血之帅，由于气虚导致机体推动、气化无力，故瘀血停留，必然影响心主血脉之功能。气虚也可导致机体津液转运、疏布、排泄异常，津液集聚，凝炼为痰，此外中气亏虚，脾胃不能很好运化水湿，也能聚湿生痰。瘀血疾浊互结，心脉气机受阻而发生胸痹［12］。所以益气养阴通脉为中医治疗胸痹的治疗原则，双参通脉颗粒是在益气养阴通脉法的指导下，由人参、麦冬、当归、黄芪、丹参、川芎6味药物组成，其中人参为大补元气之品，入心经，具有生津养血之功效；当归、丹参均可补血活血；人参、当归、黄芪配伍合用，共奏补益气血之效。方中麦冬具有养阴生津的作用；川芎为血中之气药，具有良好的活血行气之功效，与丹参、当归合用可增强其补血化瘀之功效，通达气血，使补而不滞；黄芪在《神农本草经》中归属于上品，《医学衷中参西录》谓其“能补气，兼能生气，善治胸中大气下陷”，前期研究也证明，黄芪皂苷用于大鼠心肌缺血再灌注损伤时，能改善心肌能量代谢，增强心肌收缩力，改善心肌缺血［13］。川芎可改善心肌细胞的肥大［14］。所以此方6味药物通过益气养阴、活血通脉标本兼治的方法来达到治疗心肌梗死的作用。本文观察结果证实，双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注损伤具有良好的疗效，能有效降低心肌梗死后再灌注大鼠心肌细胞VCAM-1及TNF-α的含量，保护损伤的心肌组织，为其在临床的推广使用提供一定的理论依据。目前随着中医药在临床的应用不断发展，中医药治疗已经取得了一定的效果。许多临床和实验研究表明中药有改善心肌缺血状态，降低血管炎性反应等作用［15］。以往临床常以西药作为主要治疗方案，总体疗效欠佳［16］。中药将为心肌梗死的治疗、提高患者生活水平提供新的途径，对于临床心肌缺血的治疗有着重要的指导意义。