葡萄糖3-脱氢酶工程菌的构建、表达及其合成3-酮对硝基苯井冈霉胺

张建芬，柯 薇，陈 虹

(浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015)

3-酮糖类化合物含有特殊羰基基团，是一种重要的合成砌块，可作为先导化合物，用于选择性合成氨基糖抗体、去垢剂、糖聚合体、食品添加剂和抗氧化剂等，具有广泛的应用前景[1]。糖分子含有多个功能相近的羟基，以此为原料，通过化学反应选择性合成3-酮糖类化合物难度较大，涉及多步的基团保护和去保护反应，而且污染大、能耗高。葡萄糖3-脱氢酶(glucoside 3-dehydrogenase,G3DH，EC.1.1.99.13)是1种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的新型氧化还原酶，能氧化吡喃糖上的C-3羟基为酮基[2]。G3DH在3-酮糖类化合物的生物合成中起着重要的作用。目前报道的能生产G3DH的微生物较少，主要有Agrobacteriumtumefaciens[3]、Flavobacteriumsaccharophilum[4]、Halomonas(Deleya)sp.A-15[5]、Cytophagemarinoflava[6]、Agaricusbisporus[7]、Stenotrophomonasmaltrophi-lia[8]和Sphingobacteriumfaecium[9]等，而且，已筛选到的G3DH的酶活性普遍不高，离满足工业生产的实际需求还有一段距离。开发经济高效的基因工程菌株，可解决自然进化的酶催化效率低、副产物多等问题，可以有效地提高生物催化剂的性能。目前，有关基因克隆G3DH的研究报道较少，仅有来自A.tumefaciens[10]和Halomonas[11]的G3DHs实现了在E.coli中的表达，而且活力较低或者表达量不高。自然界中蕴藏着丰富的未被发掘的新型酶资源，随着DNA测序技术的发展和成本的降低，大量微生物基因组信息先后被测定和公开。基因挖掘技术可以从基因组数据库快速发现新的有价值的酶，进一步丰富可被利用或改造的酶资源[12]，已吸引了广大科研工作者的关注。因此，基因挖掘新的G3DH酶资源，对于提高G3DH的催化反应效率、拓宽G3DH的应用范围具有重要意义。

3-酮对硝基苯井冈霉胺是3-酮井冈羟胺A C-N裂解酶的酶反应底物，3-酮井冈羟胺A C-N裂解酶是酶解井冈霉素制备井冈胺等糖苷酶抑制剂的关键酶之一，具有重要的研究应用价值。3-酮对硝基苯井冈霉胺可通过G3DH生物转化来制备。Takeuchi等[4]利用F.saccharophilum提取的粗酶液膜蛋白部分转化，得到了3-酮对硝基苯井冈霉胺，作为C-N裂解酶的底物。但是用酶液转化生产存在着酶液制备费时费力，收率低等缺点。项目组前期用S.maltrophilia细胞转化制备3-酮对硝基苯井冈霉胺[13]，由于野生菌株同时含有3-酮对硝基苯井冈霉胺裂解酶，会有副产物对硝基苯胺产生，使3-酮对硝基苯井冈霉胺产率下降，也会导致后续产物分离麻烦。随后，项目组克隆了来自Sphingobacteriumfaecium的G3DH，并用于3-酮对硝基苯井冈霉胺的细胞转化法生产[14]。尽管G3DH在合成中的应用前景不可忽视，目前所报道的G3DH酶种类非常有限，基因组挖掘这一方法可以快速发现新的有价值的G3DH。

本研究中，笔者通过基因挖掘的方法表达1种来自Glaciecolapolaris的G3DH，并优化其表达条件，并且用此重组G3DH工程菌细胞转化法生产3-酮对硝基苯井冈霉胺。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及引物

大肠杆菌(E.coli)DH5α和E.coliBL21(DE3)，Novagen公司，克隆质粒pMD19-T、表达质粒pET-28(b)，Takara公司。所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 主要试剂和仪器

PCR所用试剂，TaKaRa公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶，Fermentas公司；低分子质量标准蛋白、感受态细胞制备试剂盒，上海生工生物工程有限公司；质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒，Axygen公司。Bradford蛋白浓度试剂盒，南京建成公司。蛋白胨和酵母粉，OXOID公司。对硝基苯井冈霉胺为实验室合成，参照文献[13]的方法。其他试剂均为市售分析纯。

酶标仪、蛋白纯化仪和镍离子亲和层析柱，美国Bio-Rad公司。

1.3 基因挖掘

在NCBI的“protein”数据库中，以“glucose 3-dehydrogenase”或“glucoside 3-dehydrogenase”为检索词，得到多条不同来源的G3DH序列。采用Clustal W进行G3DH的多序列比对，分析G3DH的保守序列。在ExPASy的ProtParam上，计算G3DH的理论理化特性，排除预测可溶性低的，确定1种来自Glaciecolapolaris的G3DH(命名为GpG3DH)为研究对象。通过jcat对GpG3DH的基因序列进行了在E.coli中表达的密码子优化。在GpG3DH基因两端加上NcoⅠ和XhoⅠ的限制酶识别位点后，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 工程菌的构建

用NcoⅠ和XhoⅠ酶切处理质粒pET-28(b)和GpG3DH，胶回收载体和GpG3DH基因酶切产物，在16 ℃下，T4 DNA连接酶连接过夜，转化到E.coliBL21(DE3)中，转化子经菌落PCR验证和测序验证后，获得阳性重组菌株E．coliBL21/pET28b-GpG3DH。

1.5 重组酶的表达纯化

将工程菌接种于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37 ℃、180 r/min振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于100 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37 ℃、180 r/min振荡培养至OD600为0.8时，向培养物中加IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，于16 ℃诱导表达12 h，4 ℃、4 000g离心10 min，收集菌体，并用生理盐水洗涤2次。称取10 g湿菌体，加入20 mL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液悬浮细胞，于冰浴中进行超声波细胞破碎(工作2 s，间隔5 s，工作时间20 min)。4 ℃、8 000g离心30 min，收集上清液作为粗酶液。粗酶液用0.22 μm的滤膜过滤后，利用镍离子层析柱(Bio-Rad，20 mL)对粗酶液进行一步纯化，纯化的酶液经超滤脱盐后用于酶活力测定。

1.6 酶活力测定

在比色皿中加入2.6 mL pH 6.0的0.1 mmol/L的磷酸盐缓冲液，0.1 mL 0.1 mol/L的葡萄糖溶液，0.2 mL 0.4 mmol/L的2，6-二氯酚靛酚溶液，0.1 mL适当稀释的酶液，混匀。以蒸馏水做空白调零，在600 nm下测吸光度减少值。每隔30 s测定，直至3 min。

G3DH酶活力单位定义：1个酶活力单位(U)相当于在上述条件下，于25 ℃、pH 6.0条件下，1 min还原1 μmol 2,6-二氯酚靛酚所需的酶量。

图2 重组酶的表达条件优化Fig.2 Optimization of expression conditions of recombinant enzyme

1.7 3-酮对硝基苯井冈霉胺的细胞转化法生产

在50 mL的小三角瓶中，加入25 mg干质量的菌体，10 mL 50 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，充分混合后，加入2 mL 50 mmol/L对硝基苯井冈霉胺，在30 ℃、100 r/min水浴摇床中开始反应。每隔一段时间，取出0.5 mL用于检测3-酮对硝基苯井冈霉胺的含量。

1.8 底物和产物的分析方法

对硝基苯井冈霉胺、3-酮对硝基苯井冈霉胺和对硝基苯胺的浓度用高效液相色谱法(HPLC)分析。细胞转化液经12 000 r/min离心10 min后，上清液用0.22 μm的滤膜过滤后，经高效液相色谱分析，采用的是C18反相柱，25%的乙腈水溶液作为流动相，流速为1 mL/min，在398 nm下紫外检测分析。

2 结果与讨论

2.1 表达质粒pET28b-GpG3DH的构建

构建所得重组质粒pET28b-GpG3DH，经NcoⅠ和XhoⅠ酶切后，结果见图1。由图1可知，重组质粒中含有目的条带，约1.68 kb，与预测一致。质粒测序验证正确，说明重组质粒构建成功。

M—标准DNA; 1—酶切质粒DNA图1 重组质粒pET28b-GpG3DH双酶切电泳图Fig.1 Electrophoresis of double digests of recombinantplasmid pET28b-GpG3DH

2.2 重组酶的表达条件优化

在不同的培养基(LB培养基和TB培养基)下，分别加入终浓度为0.10、0.50和1.00 mmol/L的IPTG，16 ℃下诱导表达16 h。每隔2 h取样分析，结果如图2所示。由图2可知，相对于LB培养基，在TB培养基下培养，重组酶的活力更高。此外，IPTG的用量为0.1～1.0 mmol/L时，重组酶的活力影响不大。因此，确定最佳的GpG3DH表达条件:37 ℃培养至OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，16 ℃诱导表达10 h。在此条件下，GpG3DH的酶活力达到2.83×10-2U/mL。酶活力比已发现的G3DH略低[3-9]，后续可以通过定向进化等分子改造手段提高GpG3DH酶活力。

2.3 基因GpG3DH的表达结果

葡萄糖3-脱氢酶基因GpG3DH的表达情况不好，优化表达条件并没有大幅度增加GpG3DH的可溶表达，表达结果如图3所示。由图3可知，G3DH的分子量为5.5×104。据报道，已发现的G3DH的分子量在5.5×104～6.8×104[3-9]，GpG3DH的分子量与文献[3-9]报道一致。于是GpG3DH的催化反应采用E.coilBL21/pET28b-GpG3DH全细胞反应体系。

1,4—对照实验(不加IPTG诱导)；2—菌体破碎液的上清；3—菌体破碎液的沉淀；M为标准蛋白图3 GpG3DH的SDS-PAGE电泳Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of GpG3DH expression

2.4 3-酮对硝基苯井冈霉胺的细胞转化法生产

采用重组菌细胞转化法生产3-酮对硝基苯井冈霉胺。3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率Y3-KpNPV用式(1)定义。

Y3-KpNPV=C3-KpNPV/CpNPV,0

(1)

式中：C3-KpNPV表示表示任一时段3-酮对硝基苯井冈霉胺的浓度。

将菌体在不同浓度EDTA(1、5、10、15、20和40 mmol/L)的细胞转化体系下反应。24 h后检测对硝基苯井冈霉胺以及3-酮对硝基苯井冈霉胺的含量，结果如图4所示。

图4 EDTA浓度对3-酮对硝基苯井冈霉胺生成的影响Fig.4 Effect of EDTA concentration onN-p-nitrophenyl-3-ketovalidamine

从图4可以看出，随着EDTA浓度的增加，3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率逐渐增加。可见，用EDTA处理细胞，能使目标产物3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率大大增加。据文献[13-14]报道及前期的研究结果，用EDTA处理细胞，能提高G3DH催化糖及其衍生物的转化率，降低副产物的产率。对于天然酶，EDTA还能抑制Ca2+依赖的3-酮对硝基苯井冈霉胺降解酶活性。本文的研究结果与前期研究结果[13]一致。重组菌E.coilBL21/pET28b-GpG3DH虽不含3-酮对硝基苯井冈霉胺降解酶，但是，EDTA能够去除外膜蛋白的脂多糖，使得细胞膜的通透性增加[4]。细胞经EDTA处理后，生成的中间产物3-酮对硝基苯井冈霉胺容易及时地到达外环境，这样就使得被裂解为对硝基苯胺的几率大大降低。当EDTA浓度大于10 mmol/L时，3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率有所下降，其原因可能是高浓度的EDTA存在对酶有抑制作用。因此，确定细胞转化体系中，最佳的EDTA用量为10 mmol/L。

考察不同的pH条件下，对硝基苯井冈霉胺转化为3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率。菌体先用10 mmol/L EDTA 处理，在30 ℃、100 r/min条件下转化 24 h，结果见图5。

图5 pH对3-酮对硝基苯井冈霉胺合成的影响Fig.5 Effect of pH on N-p-nitrophenyl-3-ketovalidamine

从图5可以看出，在pH 7.5时，3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率最高。因此，确定细胞转化体系中，pH为7.5。

考察不同的温度(20、25、30 ℃)下，对硝基苯井冈霉胺转化为3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率。以对硝基苯井冈霉胺和3-酮对硝基苯井冈霉胺的浓度对转化时间作图，结果如图6所示。

图6 温度对3-酮对硝基苯井冈霉胺的合成影响Fig.6 Effects of temperature on N-p-nitrophenyl-3-ketovalidamine

从图6可以看出，在不同温度下的曲线形状大致相同。在转化初期，随着温度的上升，转化速率呈上升的趋势，其可能的原因是随着温度的升高，细胞膜的通透性增加，使得化学物质容易进入细胞质。因此，对硝基苯井冈霉胺容易通过细胞膜，产物容易通过到达细胞外。转化12 h后，在30 ℃下，3-酮对硝基苯井冈霉胺的产量增加较缓慢。因此，笔者选择25 ℃为最佳的3-酮对硝基苯井冈霉胺转化温度。在25 ℃、 pH为7.5的反应条件下转化32 h，3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率(Y3-KpNPV)可以达到0.54。在前期研究中[14]，S.faecium菌的G3DH的最佳转化条件为30 ℃、 pH为7.6，与本文的结果相近。

3 结论

采用基因挖掘技术，一种来自于Glaciecolapolaris的葡萄糖3-脱氢酶基因被发现，并进行了GpG3DH基因工程菌的构建和表达。表达质粒pET28b-GpG3DH被成功构建，并在E.coliBL21(DE3)中实现部分可溶表达。经镍柱纯化和电泳检测，G3DH的分子量为5.5×104。随后，优化了GpG3DH的表达条件，结果表明，相对于LB培养基，TB培养基能显著提高G3DH酶活力。重组菌在37 ℃培养至OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，16 ℃诱导表达10 h，GpG3DH的酶活力达到2.83×10-2U/mL。最后，将重组菌细胞用于转化对硝基苯井冈霉胺生产3-酮对硝基苯井冈霉胺的研究，最佳的转化体系为EDTA 10 mmol/L、pH为7.5、25 ℃，转化32 h，3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率(Y3-KpNPV)为0.54。相比较于来自Sphingobacteriumfaecium的重组菌，本实验3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率略低。后续可以通过酶定向进化、定点突变等分子改造手段提高GpG3DH酶活力。