细胞3D打印技术及应用

周为，张诚，赵丹阳

（大连理工大学 机械工程学院，辽宁大连 116024）

生物3D打印是一种涉及增材制造、生物医学、材料科学、电子信息等多个学科领域的新兴生物制造技术，它的出现极大地推动了组织工程与再生医学的发展。传统的生物3D打印技术主要利用不含细胞的生物材料来制造医学模型、金属骨骼、生物陶瓷、组织工程支架等生物制品。而随着进一步的发展，生物3D打印延伸出了新的分支细胞3D打印技术（3D Cell Printing）。细胞3D打印技术是在3D打印的基础上，以活细胞为原料结合生物材料、生命体材料的拓展延伸，打印活体组织与器官的一种技术。这种技术以计算机三维模型为基础，通过离散堆积的方法，将生物材料或细胞按仿生形态、生物体功能、细胞特定微环境等要求，用增材制造法打印出同时具有复杂结构与功能的生物三维结构、体外三维生物功能体等生物医学产品，在骨骼、皮肤、血管、心脏、肾脏、肝脏等组织等再生与重建、药物筛选等领域具有广阔的应用前景。本文主要从细胞3D打印技术的方式及特点、细胞3D打印的应用、细胞3D打印的发展前景几个方面展开简要综述。

1 细胞3D打印技术的方式和特点

1.1 喷墨细胞打印技术

喷墨细胞打印技术是最早应用于打印细胞的技术，由传统的喷墨打印技术发展而来，其原理是利用热技术或声波技术，促使液体通过受计算机控制的喷嘴产生液滴，按照预先设定好的三维结构喷射液滴。目前，用于细胞打印的喷墨打印机主要采用热喷墨或声波喷墨技术。热喷墨打印机通过电加热打印头来产生压力脉冲而使液滴离开喷嘴，其优点是打印速度快、成本低和广泛可用性，但在打印过程中，细胞和生物材料需要承受高温及较大的剪切应力，并且喷嘴易堵塞、液滴的喷射方向易发生偏差、液滴尺寸不均匀等；声波喷墨打印机使用与超声场相关的声辐射力把液滴从气液界面处喷射出，通过调节声波参数来控制液滴的大小和喷射速率，其优点是可以避免喷嘴的堵塞，能够控制液滴的尺寸和喷射方向，并能避免细胞暴露于高温和机械应力之下[1]，缺点是对于打印材料的粘度有着严格的限制。可见，喷墨细胞打印的局限性在于其打印的生物材料必须是液态的，只有在这种情况下才能形成液滴。

1.2 微挤压细胞打印技术

微挤压细胞打印技术是最常见的细胞3D打印技术，该技术利用机械控制将生物材料通过挤出头挤出沉积在基底上。目前常用的材料挤出方法有气动式和机械式（活塞或螺杆）两大类。气动式打印机的优点是其驱动机构组件简易，缺点是其挤出力的大小受到系统气压的限制、并且容易造成材料控制的延迟；机械式打印机的优点是其可以更好地实现空间控制，并且更适用于高粘度水凝胶的打印[2]，缺点是会产生较大的机械应力从而对打印的生物材料造成损伤。与其他两种技术不同的是，通过微挤压细胞打印技术将生物材料挤出后会形成连续的材料丝而不是小液滴，导致生物材料和细胞承受较大的压力和剪切应力，降低了打印出细胞的存活率，限制了其在再生医学组织领域方面的应用。

1.3 激光辅助细胞打印技术

激光辅助细胞打印技术是利用聚焦的激光脉冲在色带吸收层上产生高压气泡，将含有细胞的材料推射到接收基底上，其优点是完全避免了其他细胞打印技术中细胞或生物材料堵塞的问题，同时对细胞的损伤很小，对细胞活力和细胞功能的影响可以忽略不计[3]；缺点是打印效率较低，不适合高通量地在体外构建组织或器官，并且成本十分高昂，极大地限制了其在临床方面的应用。

2 细胞3D打印技术的应用

2.1 组织工程

2.1.1 肝脏组织打印

肝功能衰竭与多器官功能衰竭相关，是导致高发病率和死亡率的重要原因，因此肝脏组织工程一直受到广泛的关注。Faulkner-Jones等[4]首次使用人类多能干细胞（hPSCs）进行肝组织的细胞打印，打印完成后人类多能干细胞经过刺激分化成肝细胞，用于肝脏微器官工程，并且分析细胞3D打印过程对干细胞功能的影响。Bertassoni等[5]使用肝癌细胞（HepG2）、载有成纤维细胞的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶和琼脂糖进行细胞打印，在打印过程中快速降温使琼脂糖迅速固化，接着利用UV光使水凝胶完全凝胶后去除琼脂糖来产生可灌注的通道。由于肝组织对药物毒性高度敏感，细胞3D打印的肝脏组织模型在药物测试和高通量筛选方面具有巨大的应用潜力，此外，用于器官移植的肝组织细胞打印也是未来的重点研究方向。

2.1.2 心脏主动脉瓣膜打印

随着人口老龄化加重，老年性瓣膜病以及冠心病、心肌梗死后引起的瓣膜病变也越来越常见，而目前人工心脏瓣膜置换或瓣膜成形等手术治疗是心脏瓣膜病的根治方法。细胞3D打印的心脏主动脉瓣膜可以针对病患心脏特性进行私人订制，提高精确性和稳定性，同时可以降低病患身体的排异反应，显著提高瓣膜替换手术的成功率。Duan等[6]利用载有猪主动脉平滑肌细胞（SMC）、小叶间质细胞（VIC）的明胶-藻酸混合水凝胶进行细胞3D打印，随后利用钙离子化学交联形成完整的主动脉瓣膜。通过细胞3D打印的主动脉瓣膜在动物体内实验中表现出良好的瓣膜功能及可兼容性，但是由此诱发的炎症性反应及移植后钙化等病理问题需要进一步的研究[7]。

2.1.3 骨组织打印

由于人体骨骼形态不规则，并且不同性别、年龄、地区的个体形态差异较为明显，细胞3D打印技术可以根据不同人体骨骼的差异来定制化打印人工骨骼，其在医学临床应用中有着极其广泛的需求[8]。Pati等[9]利用来源于人鼻下鼻甲组织中的间充质基质细胞来产生矿化细胞外基质（ECM），提高了打印的聚己内酯（PCL）支架的成骨潜能，经过短暂的体外培养后将支架脱细胞化，与对照组相比，其表现出更强的骨诱导和骨传导性。Kundu等[10]将载有软骨细胞的水凝胶利用细胞3D打印技术打印到提前制备好的支撑性结构上，植入人体内后生成适合人体的软骨组织。尽管在骨组织的细胞打印取得了很大的进展，但具有不同结构，不同生物力学和生物学特性的骨组织细胞打印仍是一个巨大的挑战，需要进一步的研究以实现具有区域分化的骨组织打印。

2.1.4 血管组织打印

由于血管组织在组织构建体中递送营养物和氧气、去除代谢残留物方面具有不可替代的作用，只有在其基础上才能构建出结构更复杂、功能更强大的组织和器官，目前血管组织的细胞3D打印得到了广泛的关注。Kolesky等[11]利用载有成纤维细胞的甲基丙烯酸酐化明胶，结合经过人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内皮化的微直径管道进行细胞3D打印，可以制备出多细胞生物构建体，将交联完毕后的构建体迅速降温至4 ℃以液化去除Pluronic F127，最终形成完整的开放血管通道组织。Norotte等[12]将平滑肌细胞和成纤维细胞的球状体利用细胞3D打印技术植入支撑性琼脂糖凝胶的适当位置中，经过体外的适当处理、培养也形成了相应的血管组织。通常在传统的生物3D打印中难以产生血管组织，但是通过细胞3D打印技术就可以很好地解决这一难题。

2.1.5 神经组织打印

神经系统的损伤是一种严重影响人们生活的疾病，带来沉重的家庭以及社会负担。利用细胞3D打印技术不仅可以增强组织工程构建体的神经支配功能，还能够直接产生新的神经组织，在治疗神经系统损伤的医学领域有着广泛的研究价值。Owens等[13]将分离的小鼠骨髓干细胞和施万细胞分别浇注在微直径管中后进行细胞3D打印，使用微挤压细胞打印技术将其以离散的管状形式挤出，被挤出的施万细胞被小鼠骨髓干细胞包裹，最终形成致密的神经导管。Pateman等[14]利用细胞3D打印技术进行基于PEG的神经引导导管打印并用于神经修复的研究，其打印神经引导导管的分辨率与自体移植物对比，具有更好的分辨率。

2.1.6 皮肤组织打印

通过细胞3D打印技术构建的组织工程皮肤不仅可以应用于烧伤、溃疡、创伤等造成的皮肤损伤修复、移植，还可以作为体外模型用于皮肤相关产品检测及皮肤疾病机理研究等。Vivian等[15]使用角质形成细胞和成纤维细胞利用细胞3D打印技术分别打印表皮和真皮组织，使用胶原蛋白来替代皮肤的真皮基质，优化相关细胞打印参数来提高细胞存活率，同时确定合适的表皮和真皮细胞密度来模拟人体皮肤的生理相关环境。通过组织学和免疫荧光表征证明其利用细胞3D打印技术构建的皮肤组织在形态学和生物学上与天然人体皮肤组织类似。Stefanie等[16]利用激光辅助细胞打印技术将成纤维细胞和角质形成细胞定位在稳定基质之上，经过体外适当培养制备出完全细胞化的皮肤替代物。

2.2 细胞传感器

细胞传感器（Cell-based biosensors，CBBs）是利用活细胞作为分子识别敏感元件，感应环境中的毒性物质及污染物的装置。目前，以原核和真核细胞为主的细胞传感器已成为一种快速检测工具，其在环境监测、药品研发、食品工业等领域显示出巨大潜力。

在基于微电极的细胞传感器中，为准确地测定细胞的电位变化，需要使细胞固定在细胞传感器中的微电极上，这就需要细胞具有良好的位置稳定性。通过细胞3D打印技术不仅可以高通量地制备载有细胞的水凝胶、还可以在微米量级精确控制细胞的位置[17]。Hui等[18]将苦味受体细胞（味觉细胞STC-1和ICR小鼠味蕾细胞）作为感应原件培养在丝网印刷玻碳电极表面，利用阻抗图谱信号研究促味剂对它的应激反应作用。pH传感器广泛应用于以pH值为参照数的工业、电力、农业、医药、食品、科研和环保领域，通过细胞3D打印技术提高其灵敏度具有极大的研究意义。Bashir等[19]设计的细胞传感器对pH值变化极其灵敏，通过原子力显微镜进行偏转测量来测定pH值的变化，其可以测定出最低5×10-5pH的酸碱值变化。

2.3 药物代谢动力学和药物筛选

目前，主要采用体外（in vitro）、体内（in vivo）及计算机模拟的方法，对先导物的药物代谢和药物动力学特征进行早期高通量快速评价。由于人体组织器官的复杂性，很难通过计算机模拟出准确的药物代谢过程，通常需要和体外模型结合起来对药物进行早期的筛选和评价。在药物实验室中，通常使用动物体模型来对药物进行筛选和检测，但是由于动物体的组织器官和人体存在一定的差异性，仅根据动物体的实验结果不足以评价药物对人体的影响，而且很多病原体对器官的影响具有个异性如丙型肝炎。为了更加准确、实时地表达出药物对人体的影响，在药物研发中构建基于人体细胞的体外模型是十分有必要的，不仅可以准确地反映出人体对药物的整个反应过程，还可以降低药物研发过程的成本。

细胞3D打印技术可以将细胞均匀地沉积在微型器件的表面上，这种均匀性非常适用于测试和筛选细胞和药物之间的相互作用。Orive等[20]设计了一种仿生细胞-水凝胶胶囊，可以促进封闭环境内细胞的长期功能表达、提高受控药物传递胶囊的机械稳定性、治疗中枢神经系统（CNS）疾病等各种病理问题。Chang等[21]开发了一种气动式细胞打印机，利用载有肝细胞的水凝胶对肝脏药物测试平台进行原型设计，该平台可以表达出不同的药物代谢水平。细胞3D打印技术还可用于在微器件界面的每一侧均匀地接种细胞层来形成器官芯片，器官芯片可以模拟出器官的局部代谢功能，有助于研究药物之间的相互作用及其对组织器官的潜在影响。

2.4 肿瘤研究

目前，二维肿瘤模型广泛应用于癌症研究中，但是由于缺乏细胞之间的立体相互作用，不能代表肿瘤生存的真实生理环境，从而无法准确、实时地反映出肿瘤对人体组织器官的具体影响。由于细胞3D打印技术可以准确定位各种细胞类型从而模拟出近似人体生理环境的癌症微环境，可以为研究癌症发病和转移机制提供极大的助力，细胞3D打印技术对于肿瘤领域方面的医学研究有着巨大的研究潜力。Demirci等[22]利用细胞3D打印技术首次打印出体外肿瘤组织模型，使用双喷头喷墨细胞打印机对人卵巢癌细胞（OVCAR-5）和成纤维细胞（MRC-5）进行细胞打印，以高通量和可重复的打印方式形成多细胞腺泡，并构建出具有空间介导的微肿瘤环境。Sun等[23]将海拉细胞（HeLa）包封于明胶-藻酸盐-纤维蛋白原复合水凝胶中进行细胞打印来制备宫颈肿瘤模型，其打印的构建体中细胞存活率达到90%，经过适当培养后海拉细胞相互迁移并在水凝胶细丝内形成细胞聚集体，与二维肿瘤模型中培养的细胞相比，其具有较高的化学抗性和金属蛋白酶表达能力。虽然目前已经利用细胞3D打印技术成功制造出了简易的三维肿瘤模型，但未来还需要制造更大的组织模型来研究癌细胞运动和迁移机制。

3 细胞3D打印技术的发展前景

随着科学技术的不断进步，越来越多的研究人员预言未来科学的重大进展将发生在生命科学与快速成型技术、生物制造技术、生物科学和材料科学的交叉领域研究上。因此，有关细胞3D打印技术的研究不仅对生命科学前沿理论的形成奠定良好的基础，而且也将极大地促进和推动制造科学、材料科学等众多领域的进一步深入发展。

目前，细胞3D打印技术的发展机遇与挑战并存，如开发新型的生物墨水，使其机械、流变、化学和生物学特性达到所需要打印器官组织的理想要求；标准化生物墨水配方，由于打印功能多样、结构复杂的组织通常需要进行多类型细胞的同步打印，缺乏标准化的生物墨水无法保证细胞在同类型打印过程中的存活率，极大地提高了细胞3D打印的难度；除此之外，生物墨水的保质期较短，长期储存极其困难，也较大地限制了细胞3D打印的应用发展。种子细胞的来源是限制细胞3D打印技术发展的另一个主要因素，其原因在于选用来自不同供体的细胞可能会导致免疫反应发生的危险，并且迄今为止还无法使干细胞分化成全部的细胞种类。从细胞3D打印的工艺上来分析，目前细胞3D打印的打印精度不能保证细胞外基质和多类型细胞复杂微结构的精确成形，并且对打印后的细胞提供特定生长微环境并进行功能化诱导，使独立的细胞个体融合成有功能的组织也需要进一步研究。

在不远的将来，随着多学科的整合和技术突破，诸上问题必将一一解决，细胞3D打印技术将成为一种主流的生物制造技术，为实现人类在体外制造与人体内组织器官类似的三维构建体起到巨大的促进作用；同时也会成为一种非常简易、快速的医疗技术，达到临床上准确、快速、有效的修复受损组织和替换病死器官的水平，最终造福于整个人类社会。