重楼内生菌多样性及其应用研究

鹿璐

（西南林业大学 园林学院，云南昆明 650224）

植物内生菌是指生活史中的某一阶段生活在植物组织内，但对植物组织没有引起明显病害症状的真菌，包括那些在其生活史中的某一阶段表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏病原菌和菌根菌[1]。药用植物内生菌的研究始于1993年，Stierle等[2]从短叶红豆杉的韧皮部分离得到一株名为安德氏紫杉霉（Taxomyces andreanne）能产生紫杉醇的内生真菌。内生菌普遍存在于植物各部分组织中，具有丰富的多样性。部分植物内生菌在促进宿主植物生长、生物防治及基于生物活性研究的药物开发等方面具有经济开发价值及生态效益。

重楼是百合科（Liliaceae）重楼属（Paris L.）植物的统称，药用的主要是滇重楼[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.)Hand. Mazz].和华重楼[Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.)Hara]。作为云南白药、宫血宁等著名中成药的主要原料，其根茎中含有的皂苷类化合物，具有抗癌、止血、消炎和免疫调节等的活性。当前，重楼的发展面临野生资源消耗过快，人工种植种苗繁育技术难度大，生长周期长等难题。这些特性使得重楼成为当前药用植物内生菌的研究热点植物之一，重楼内生菌的研究对于其资源保护和开发利用具有非常重要的意义。本文将对近些年重楼植物内生菌的研究作概述。

1 重楼植物内生菌的分离、鉴定及多样性

多年来，多位研究者采用培养法对不同地理种源的重楼植物内生菌进行分离、鉴定，对其多样性进行了阐释。段荣婷等[3]从云南弥勒和临沧两地野生滇重楼分根、茎、叶3个部位分离得到42株内生真菌。利用形态学分析及ITS序列分析进行鉴定，分离所得内生真菌归属于16个属，其中弥勒滇重楼归属于13个属，而临沧滇重楼归属于8个属。王茜等[4]通过对云南省嵩明县、鹤庆县、保山市野生滇重楼植株的根、块茎、叶中分离，共得到内生真菌749株。基于ITS序列分析和形态学方法进行鉴定，所得菌株归属于41个属，其中3个属仅在根部出现、12个属仅在块茎出现、8个属仅在叶部出现。周先治等[5]分离了华重楼健康植株和茎腐病感病植株根茎、茎、叶等不同部位的细菌，共获得65株内生细菌。采用DNA测序技术，进行了初步鉴定。健株中的内生细菌分属4属11种，以芽孢杆菌为优势菌群，根茎部菌量最高，叶部菌量较低。病株的内生细菌分属10属14种，以假单胞菌为优势菌群，茎部菌量最高，叶部较低。不同植株或同个植株的不同部位内生菌多样性不同。魏娟等[6]从人工栽培云南重楼的根茎中分离纯化得到40株内生细菌，其中芽孢杆菌属（Bacillus）和肠杆菌属（Enterobacter）分离频率分别为35%、27.5%，是其优势内生细菌群；野生云南重楼的根茎中分离纯化得到44株内生细菌，芽孢杆菌属（Bacillus）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）分离频率分别为36.4%、20.4%，是其优势内生细菌群。廖秋红等[7]利用栽培于云南大理的滇重楼为实验材料，对其叶、茎、根状茎等部位的内生细菌进行了分离、纯化，叶中分离纯化得到18株内生细菌，茎中分离纯化得到9株内生细菌，根茎中分离纯化得到22株内生细菌，共49株内生细菌。通过16S RNA测序方法对其种类进行鉴定。结果显示滇重楼叶中内生细菌含有8属11种，茎中含有2属5种，根茎中含有9属11种。此外，还有多人对重楼内生菌进行分离、鉴定，详细情况总结于表1。

表1 重楼属植物内生菌分离、鉴定统计表

2 重楼植物内生菌的应用

2.1 抑菌活性

重楼植物内生菌的抑菌活性研究主要集中于分离所得的菌对常见作物致病菌、土传病原菌及人类病原菌等的抑制作用。施蕊等[10]从滇重楼块茎中分离得到98株内生真菌。采用平皿对峙培养法和发酵液萃取物制平板的方法筛选出部分对土传病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有抑制作用的菌株。孙静贤等[12]对10株分离自滇重楼的内生真菌的发酵物乙醇提取物进行抗菌活性检测，采用滤纸法以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气肠杆菌为指示菌。结果发现7株对金黄色葡萄球菌有抑制作用。其中菌株YL0401发酵物乙醇提取物具有较高的抗菌活性，结合形态学特征和ITS-rDNA序列分析鉴定菌株YL0401为墙粘鞭霉（Gliomastix murorum）。宣群等[13]分别于春冬季从滇重楼植株不同部位分离得到内生真菌19株。在体外，用指示菌株金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、大肠埃希菌及白色念珠菌进行抑菌活性筛选，最终得到一株编号为的LRF4内生真菌菌株对白色念珠菌有较强抑制作用，形态鉴定为无孢菌群。杨正强等[14]从华重楼的地下块茎中分离到一株内生细菌（SS02），试验表明其发酵液对绿色木霉（Trichoderma viride）、芦笋茎枯病菌（Phoma asparagi Sacc）、番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）、杨树溃疡病菌（Dothiorella gregaria）等13种作物致病菌的生长有抑制作用。形态和生理生化特征表明，SS02属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）细菌。雍彬等[19]从华重楼块茎中分离纯化得到一株具有较强抑菌活性的内生细菌Iun35，经形态特征、生理生化特性及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。将分离得到的Iun35菌株发酵培养，培养液上清经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白UD35。用该蛋白对多种植物病原菌进行拮抗测定，结果显示，Iun35对玉米纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kuha）等多种菌有强烈抑制作用。程媛媛等[20]利用前期从华重楼根状茎中分离出的一株具有较强抗菌活性的细菌PCE45。对该菌产生的抗菌肽PCP-1进行了分离纯化，采用平板对峙法研究抗菌肽对真菌菌丝和孢子的影响。研究发现实验所获得的抗菌PCP-1热稳定性好，且对蛋白酶K和胰蛋白酶都有较好的耐受性。抗菌肽PCP-1抑菌谱广、活性强，对许多危害严重丝状真菌、细菌都表现出很强的抗菌活性。

2.2 促生作用

内生真菌可以从宿主植物中吸收营养物质供给自身生长发育的需要，可以提高抗性，并在宿主植物的生长发育和繁殖中起重要的作用。周浓等[21]发现接种AM真菌能促进滇重楼幼苗的存活率，且不同AM真菌菌株会影响滇重楼内源激素量。杨玲玲等[22]采用的分离、筛选固氮菌的阿须贝氏（Ashby）培养基进行培养，结果得到25株阳性菌株。宋发军等[15]利用中南民族大学生命科学学院存有的60株重楼内生细菌发酵液的水相提取液和有机相提取液对冬小麦种子萌发的影响，发现8株细菌的有机相提取物具有较明显的促萌发作用。其中肠杆菌属74#菌的石油醚相提取物、不动杆菌属108#菌的氯仿相提取物、芽孢杆菌属138#菌的氯仿相提取物和克雷白氏杆菌属149#菌的乙酸乙酯相提取物具有较强的促萌作用。而内生菌发酵液的水相提取物均不能促进冬小麦种子的萌发，甚至存在一定的抑制作用。

2.3 生物活性

从植物体中分离的内生菌通过液体发酵培养后，检测内生真菌体甾化合物的含量和产量，可为深入研究内生真菌甾体化合物的代谢规律奠定基础。赵明等[8]从华重楼根茎中分离了107株菌，并通过TLC检测菌株发酵产物筛选得到了2株可产甾体皂甙的内生菌。任智等[9]从华重楼根茎中分离了107株菌，并通过TLC检测菌株发酵产物筛选得到了2株可产薯蓣皂甙的内生菌；16S rDNA 序列分析将其鉴定为Exiguobacterium acetylicum，与 Bacillus subtilis RZ07。欧亚娟等[16]以七叶一枝花为材料，利用HPLC检测对七叶一枝花内生真菌产生的薯芋皂甙元的含量进行了比较，筛选出9株属于4属的七叶一枝花块茎内生真菌。张晓洁等[11]从产自四川彭州的华重楼地下块茎中分离得到16株菌。经TLC检测筛选得到一株编号为SNUS-1（AY842149）的菌株能分泌重楼皂甙或其类似化合物。16S rDNA测序结合该菌株的形态及生理特征确定将其为托氏假单孢菌（Pseudomonas tolassii）。之后张晓洁等[23]又从野生滇重楼中分离得到16株菌。发酵培养后，发酵液分别经泡沫反应、Salkowski反应、Liberman反应及以薯蓣皂甙元为标准对照的薄层层析分析，发现编号为SNUF-1的真菌和编号为SNUA-1、SNUA-2的放线菌菌株能分泌甾体皂甙或其类似化合物。曹晓冬等人[24]从滇重楼根状茎中分离到133株内生真菌。对其中的7株真菌进行了生物学性状观察但并未对其进行具体的鉴定，通过发酵培养测定了发酵液中甾化化合物的产率。

2.4 生物转化

李忠孝等[18]结合形态学特征和ITS-rDNA序列分析确定菌株YNCA1219的分类学地位，菌株YNCA 1219鉴定为稻恶苗霉（Fusorium moniliforme Sheld.）。由HPLC图可以看出，菌株对孕酮的转化比较完全，得到2个转化产物：11α-羟基孕酮和11α,15β-二氢基孕酮，可进一步做的工作。

3 问题与展望

内生真菌普遍存在于目前已研究过的各种药用植物中。从目前已经研究过的药用植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，可以推断内生真菌在药用植物体内普遍存在[25]。药用植物中，青霉属、镰刀菌属、曲霉属、木霉属、交链抱属等的出现频率较高[26]，根据统计在重楼植物中这些属的内生菌出现频率也较高。但总体来说不同样地、不同部位的重楼材料所分离得到的内生菌仍具有较大差异性，这样丰富的多样性可能与样地生境以及各部位结构、成分等多种因素有关。

虽然对重楼植物内生菌的多样性及应用等方面已经有了一定研究，但关于内生菌与重楼之间的共生机制与内生菌可产皂苷等宿主植物相似代谢产物的原理仍然有待研究。几乎所有的植物都存在内生菌，它们与宿主植物协同进化，一同构成稳定的关系。一些理论认为宿主植物与内生菌的共生体内，一旦次生代谢中有用生化途径出现，该途径就能被其他生物利用，表现出相互作用和协同进化。内生菌在与宿主植物长期的协同进化中也可能通过遗传信息的传递获得宿主植物的特定代谢途径，从而使内生真菌产生与宿主相同或相似的生理活性成分[27]。从次生代谢的角度探讨重楼与内生菌之间的相互作用和协同进化关系，或可更好地了解其共生机制及内生菌可产重楼植物相似代谢产物的原理，解决重楼植物内生菌的次生代谢产物含量由于分离纯化及频繁传代导致的含量不稳定等问题[28]。

从研究方法上来说，重楼植物内生菌的研究多数是先利用培养法来分离鉴定内生菌，但即使使用多种不同的培养基进行分离培养，仍无法将所有生活在植物组织内的内生菌全部被分离出来，有的内生菌不能离开宿主植物在人工培养基上生长，有的存在量极小难于分离，有的在严格的表面消毒过程被误杀。在其他一些植物上，也有使用免培养法对植物内生菌多样性进行研究，然而一些研究发现培养法分离鉴定得到的有些菌种在免培养法鉴定中并未获得。因此，为更加全面地对滇重楼属植物内生菌多样性展开研究，未来应充分结合两种分析方法进行使用。

总体来说，重楼植物内生菌的研究已有了不少研究成果，但目前内生菌在药用植物领域的应用仍处于起步阶段，研究多限于内生菌对宿主植物生长发育、有效成分等的研究，对其具体作用机制仍不明确，其实际应用效果也还有待研究和实践，未来还有更多研究需要去做。