95%2甲4氯异辛酯原药小鼠骨髓多染红细胞微核试验研究

王 爽，纪 磊，徐 剑，岑江杰，林师道，方 华，钱浙斌

（浙江省化工研究院有限公司，浙江 杭州 310023）

2甲4氯异辛酯是一种激素型选择性除草剂，具有较强的内吸传导性，能和多种除草剂复配，防治水稻田、小麦田多种杂草。2甲4氯异辛酯属于苯氧乙酸类除草剂，具有用量少、对敏感作物安全性高、对人畜等毒害作用较小的优点，在化学除草领域中得到较广的应用。在使用时其附着性好，在植物体内易分解成有效成分2甲4氯酸，传输速度更快，除草效果优于同类产品2甲4氯钠、2，4-D丁酯[1]，更重要的是杂草对其产生抗性的速度较为缓慢。目前对于95%2甲4氯异辛酯原药及其混配制剂的毒理学研究几乎未见报道。

微核（Micronucleus）是在细胞有丝分裂后期，不能进入子代细胞核中的染色体的断片或迟滞的染色体，在子代细胞胞浆内形成的一个或几个次核，其与细胞主核着色一致，呈圆形或椭圆形[2]。它是由染色体、染色单体的无着丝粒断片或纺锤体损伤后造成滞后染色体在细胞分裂中未包被于主核中形成。在形态上，微核为完全游离于细胞浆中，染色及结构与主核一致，直径通常为红细胞的1/20～1/5。断裂作用和非整倍体化作用是微核产生的最主要的原因。通常认为前者产生的微核主要由无着丝粒断片形成，后者产生的微核则由整条染色体形成。但几乎所有诱发微核的因素都兼有两种作用。微核形成是细胞受遗传毒物作用后的一种遗传学终点，以观察细胞中微核的形成来检测遗传毒物，称为微核试验。该试验快速、简便，许多国家和国际组织都将其规定为评价农药 、新药、食品添加剂等化合物毒理学评价的必做遗传毒理学试验之一[3]。

本研究应用体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验检测95%2甲4氯异辛酯原药致突变性，为其毒理学安全性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试品

95%2甲4氯异辛酯原药，褐色透明液体，无刺激性气味，不溶于水，由国内某作物保护公司提供。

1.2 动物

SFF级ICR小鼠共60只，雌雄各半，体重25～30 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK＜京＞2016-0011。动物饲养于屏障设施内，观察及适应3天，合格动物用于试验。试验动物的饲养环境温度控制在18℃～25℃。自由采食、饮水。SPF大小鼠生长繁殖饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供。

1.3 试剂与器材

环磷酰胺（CP），批号为 120M1253V，生产厂家为SIGMA；甲醇，批号为2016102401，生产厂家为成都市科龙化工试剂厂；Giemsa染液 （自制），甘油（分析纯），小牛血清。手术器械，带油镜头显微镜（日本奥林巴斯株式会社），细胞计数器等。

1.4 试验方法

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验按照《农药登记毒理学试验方法》（GB/T 15670-2017）进行操作[2]。本实验室测得95%2甲4氯异辛酯原药对雌雄小鼠经口LD50均为1470 mg/kg。本试验将60只小鼠随机分成5组，每组12只，雌雄各半。分别为阴性对照组（玉米油，10 mL/kg）、阳性对照组 （环磷酰胺30 mg/kg腹腔注射）、低剂量组（200 mg/kg）、 中剂量组 （400 mg/kg）、 高剂量组（800 mg/kg）。阴性对照组（玉米油）和3个剂量组均按0.1 mL/10 g体重每天1次经口灌胃；阳性对照组按0.1 mL/10 g体重每天1次腹腔注射。各给药2次，间隔24 h。于第2次给药后6 h颈椎脱臼处死动物后，取胸骨，挤出骨髓液于载玻片小牛血清里，混匀，涂片自然晾干后放入甲醇中固定15 min，将固定好的涂片放入Giemsa染色约30 min，用蒸馏水冲洗，晾干。每组检查5只动物，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCE），并计数含微核的嗜多染红细胞数，计算微核率以及嗜多染红细胞与红细胞总数的比例。嗜多染红细胞微核率 （‰）=（含微核的嗜多染红细胞数/嗜多染红细胞总数）×1000。

1.5 统计学方法

采用SPSS 24.0软件，统计各组微核细胞率的均数和标准差，应用泊松（Poisson）分布对各剂量组与阴性对照组的微核率进行比较。

2 结果

试验过程中各剂量组动物染毒后2 d内均未出现中毒症状。本试验所用ICR小鼠胸骨骨髓的自发微核千分率（‰）为0.80±0.98，各剂量组小鼠的微核率分别与阴性对照组相比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。各剂量组雌雄动物的微核率均小于2‰；而阳性对照组小鼠的微核率显著地高于阴性对照组（P＜0.01），阳性对照组环磷酰胺诱发的微核率雌雄动物均不低于17‰。见表1。

表1 95%2甲4氯异辛酯原药小鼠骨髓多染红细胞微核试验结果

3 讨论

本试验ICR雌雄小鼠骨髓微核的自发率均小于3‰，阳性对照环磷酰胺微核率与阴性对照组相差超过10倍，差异显著，表明试验可行、可靠。在微核试验中常用环磷酰胺为诱变剂作阳性对照，给药剂量和取样观察时间对小鼠骨髓微核率的影响较大。根据体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验（GB/T 15670.15-2017），取胸骨或股骨制片均可，环磷酰胺参考剂量和途径为40 mg/kg（灌胃，ig）或 30 mg/kg（腹腔注射，ip）。有文献报道用环磷酰胺作为诱导小鼠骨髓细胞微核的阳性对照时，剂量可选择60～90 mg/kg，取样时间在给药后36～48 h，采用一次腹腔注射、胸骨取材可取得较高微核率，结果令人满意[4]。环磷酰胺经口一次给药时，其剂量范围在40～80 mg/kg，采集样本的时间应在给药后24～30 h，胸骨髓是微核试验的最好材料[5]。根据文献报道并结合实际情况，本试验取胸骨制片，环磷酰胺剂量和途径为30 mg/kg（ip），取得了满意的效果，与文献报道基本一致。

4 结论

本试验各剂量组小鼠骨髓细胞微核率未见异常，表明95%2甲4氯异辛酯原药对小鼠骨髓多染红细胞无致突变作用。本试验为致突变的初筛试验，可为后续的毒理学试验提供参考，最终是否有遗传毒性，还需要一系列的试验组合加以验证，如细菌回复突变试验，哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验等。