miR-16通过靶向调控YAP1基因表达影响肺癌细胞的增殖

周芸 张筠 楼玉凤 方力争

(1浙江大学医学院全科医学科，浙江 宁波 310058；2宁波大学医学院附属医院呼吸内科；3浙江大学医学院附属邵逸夫医院全科医学科)

虽然随着治疗技术手段的不断发展，但肺癌的远期生存率仍没有显著提高。因此，提高肺癌的早期诊断、早期治疗具有重要意义〔1，2〕。miRNA能够通过负性调控靶基因转录，进而参与细胞的增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。大量学者通过miRNA芯片技术、微阵列技术、荧光定量PCR等技术手段证实了肺癌肿瘤组织、血浆中存在着多种miRNA的差异性表达，并提示miRNA是肺癌早期诊断的有效指标〔3，4〕。miR-16是较早发现的一种抑癌miRNA，在包括肺癌在内的多种肿瘤组织中低表达，但在肺癌发生发展过程中的具体机制尚未明确〔5，6〕。同时，miRNA在细胞生物学中的作用几乎都是通过调控靶基因表达来实现的。因此，本研究将探讨miR-16对肺癌细胞增殖、凋亡的影响及对相关靶基因的调控作用。

1 材料和方法

1.1细胞株 肺腺癌细胞A549、H1050、H1299，肺鳞癌细胞NCI-H520、NCI H596及人胚肺细胞MIRC-5均购于中国科学院上海细胞库。

1.2主要试剂和仪器 兔抗人Yes相关蛋白(YAP)1及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体均购于美国Cell Signal Technology公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒，Hoechst33258染色试剂盒均购于南京凯基生物技术有限公司；Trizol总RNA提取试剂盒，LipofectamineTM3000脂质体，反转录试剂盒(第一链cDNA合成试剂盒)均购于大连宝生物技术有限公司；miR-16 mimics和miR-16 NC均购于上海吉马生物技术有限公司；重组质粒pGL3 YAP1 3′UTR-Wt及pGL3 YAP1 3′UTR-Mut购于广州锐博生物技术有限公司。DYCZ-40D型转印电泳仪，DYCZ-425D型双垂直电泳仪均购于北京六一仪器厂；168-1000XC型酶标仪，FACSCalibur型流式细胞仪购于美国BD公司；GelDoc 2000型凝胶成像系统购于美国伯乐公司；IX51倒置显微镜购于日本OLIMPUS公司。

1.3细胞转染 当A549细胞密度达到50%时，利用LipofectamineTM3000脂质体将稀释好的miR-16 mimics和miR-16 NC转染到A549细胞中，6 h 后细胞换液并继续培养48 h，采用RT-PCR法检测细胞中miR-16的表达。

1.4RT-PCR法检测细胞中miR-16及YAP1表达 根据Trizol试剂盒说明书提取总RNA，当检测出的RNA纯度良好时候，根据逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，最后进行琼脂糖凝胶电泳。

1.5MTT法检测细胞活力 将5×103个A549细胞接种到96孔板，培养24 h，按“1.4”转染48 h后，加入MTT试剂孵育4 h，后舍去上清液，加入二甲基亚砜，微量振荡器震荡使结晶物溶解，利用酶标仪检测OD570 nm值，所测OD值即细胞活力。

1.6软琼脂糖克隆形成实验 将8×103个A549细胞接种到6孔板，培养24 h后，按“1.4”转染48 h后，消化细胞并制成单细胞悬液。制作1.2%及0.7%的琼脂糖液，首先将1.2%琼脂糖与两倍体积的DMEM培养基混匀，倒于6 cm培养皿，室温下冷却。接着0.7%琼脂糖液与两倍体积的DMEM培养基混匀后，加入单细胞悬液继续混匀，后倒于铺有1.2%琼脂糖的平皿中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，并于显微镜下观察计数。

1.7Hoechst法检测细胞凋亡情况 将8×103个A549细胞接种到6孔板，培养24 h后，按“1.4”转染48 h后，用甲醇∶乙酸混合液固定细胞30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，加入Hoechst33258染色液染色10 min，于倒置显微镜下观察，细胞核皱缩，浓染并呈碎片说明细胞凋亡，最后用Image J软件进行统计分析。

1.8流式细胞术检测细胞周期 将8×103个A549细胞接种到6孔板，培养24 h后，按“1.4”转染48 h后，每组收集1×105/ml个细胞，再加入5 μl的Rnase吹打混匀后于室温下孵育1 h，接着加入PI染液在室温下避光孵育30 min，最后进行流式检测，并对细胞周期进行分析。

1.9Western印迹检测细胞中YAP1表达 收集细胞并裂解，离心收获上清液获得总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白煮沸变性，制作浓缩胶及分离胶，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，聚偏氟乙烯(PVDF)膜湿法转膜。2%的牛血清白蛋白(BSA)室温下孵育1 h，一抗溶液(兔YAP1及GAPDH单克隆抗体，稀释度为1∶100) 4℃过夜孵育，第二天在室温条件下，与二抗溶液孵育1～2 h，在凝胶成像系统中曝光。最后用Quantity one软件进行统计分析。

1.10荧光素酶报告基因表达分析 将miR-16 mimics+pGL3 YAP1 3′UTR-Wt，miR-16 NC+ pGL3 YAP1 3′UTR-Wt，miR-16 mimics+pGL3 YAP1 3′UTR-Mut，miR-16 NC+ pGL3 YAP1 3′UTR-Mut四组miR-16与YAP1的重组载体转入SW480细胞中，并根据双荧光素酶检测系统检测每组细胞的荧光素酶活性，计算公式：相对荧光值=萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值。

1.11统计学分析 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1miR-16在肺癌细胞株及正常胚肺细胞中的表达 miR-16在A549、H1050、H1299、NCI-H520、NCI H596及MIRC-5中的表达分别为(0.38±0.03)、(1.35±0.01)、(1.10±0.11)、(1.43±0.14)、(1.56±0.15)、(2.38±0.25)。与MIRC-5比较，肺癌细胞中miR-16表达量下调(P<0.01)，且在A549细胞中下调程度最高，因此选为后续实验研究对象。

2.2miR-16 mimics转染效果的检测 miR-16 mimics和miR-16 NC转染48 h后，与miR-16 NC组(0.36±0.03)比较，miR-16 mimics组中miR-16表达量(1.89±0.12)显著上调 (P<0.01)。

2.3miR-16 mimics对A549细胞活力及细胞克隆能力的影响 miR-16 mimics和miR-16 NC转染A549细胞24、48、72 h后，与miR-16 NC组比较，不同转染时间点miR-16 mimics组细胞活力均显著降低(P<0.01)。在转染48 h后，与miR-16 NC组(120.52±12.29)比较，miR-16 mimics组(32.46±3.28)细胞克隆形成数目显著减少(P<0.01)。见图1，图2。

与miR-16 NC比较:1)P<0.01图1 miR-16 mimics对A549细胞活力的影响

图2 miR-16 mimics对A549细胞克隆形成能力的影响

2.4miR-16 mimics对A549细胞凋亡及细胞周期的影响 miR-16 mimics和miR-16 NC转染A549细胞48 h后，与miR-16 NC组比较，miR-16 mimics组细胞凋亡率显著提高(P<0.01)，且细胞周期阻滞于G1期 (P<0.01)。见图3，表1。

图3 miR-16 mimics对A549细胞凋亡的影响(×200)

组别细胞凋亡率细胞周期G1期S期G2期miR-16 NC组5.48±0.5548.21±4.8232.84±3.6818.95±1.90miR-16 mimics组39.63±3.961)62.35±6.231)16.10±1.611)21.55±2.151)

与miR-16 NC组比较：1)P<0.01

2.5荧光素酶报告基因分析 miR-16 mimics+pGL3 YAP1 3′UTR-Wt组的荧光强度低于其他转染组(P<0.01)，且另外三组间荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6miR-16 mimics对A549细胞中YAP1蛋白及mRNA表达量的影响 miR-16 mimics和miR-16 NC转染A549细胞48 h后，与miR-16 NC组(0.98±0.08，0.95±0.05)比较，miR-16 mimics组YAP1蛋白(0.14±0.01)及mRNA(0.10±0.01)表达量显著下调(P<0.01)。见图4。

图4 miR-16 mimics对A549细胞中YAP1 mRNA及 蛋白表达的影响

3 讨 论

miRNA是一类高度保守的与靶基因3′UTR区域特异性结合的小RNA分子，其基因组常处于肿瘤基因的脆性区，因此常作为促癌miRNA或者抑癌miRNA参与肿瘤的发生发展〔3，4〕。miR-16基因组定位于13q14.3，是首个被发现与肿瘤密切相关的miRNA。miR-16在血液系统肿瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤组织或血液中低表达，并成为上述癌症早期诊断的有效指标〔6，7〕。但miR-16在肺癌中的具体作用尚不明确。

本研究结果表明肺腺癌细胞株A549、H1050、H1299，肺鳞癌细胞株NCI-H520、NCI H596中miR-16表达量均显著低于MIRC-5，此结果与miR-16在肺癌中的表达趋势一致〔5〕，也与miR-16在其他肿瘤细胞株中的表达趋势类似〔8～10〕，提示miR-16在肺癌中起抑癌作用。同时，本研究结果表明miR-16 mimics能显著诱导A549细胞凋亡，与miR-16 mimics在胶质瘤细胞、胃癌细胞中作用效果一致〔8，10〕，从而说明miR-16 mimics能显著抑制A549细胞增殖，并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞的无限增殖源自于细胞周期的紊乱与不可控制，特别是细胞周期调控点G1、S、G2，已经成为众多抗癌药物的作用靶点之一〔11，12〕。本研究结果也表明miR-16 mimics能显著阻滞A549细胞周期于G1期。

miRNA在肿瘤细胞中主要通过调控下游靶基因的转录发挥其生物学效应〔8，9〕。本研究前期通过靶基因预测软件miRanda发现了YAP1可能是miR-16的靶基因之一，miR-16与YAP1的3′UTR区域可能互补，因此本研究对此展开了进一步的验证。YAP1蛋白是YAP1基因的编码产物，是一种富含脯氨酸的磷蛋白，含有8种异构体，是Hippo信号通路中的关键一员，在包括肺癌在内的多种肿瘤组织中高表达。YAP1通过Hippo信号通路参与细胞的生长、分化与凋亡等生物学过程〔13〕。YAP1在正常生理条件下不表达或者低表达，在被上游信号激活后，能够极大加速细胞的增殖及恶性转化。目前对YAP1的了解还有限制，已报道YAP1能与miRNA相互作用进而发挥功能〔14〕。本研究利用荧光素酶报告基因证实了miR-16能够特异性结合于YAP1的3′UTR区域，使荧光强度降低；同时，RT-PCR及Western印迹结果也说明miR-16能够负性调控YAP1表达，二者存在靶向调控关系。有研究表明沉默YAP1表达能显著抑制A549细胞增殖〔15〕，进而说明上调miR-16表达负性调控YAP1表达能够显著抑制A549细胞增殖。

综上所述，miR-16在肺癌细胞株中低表达，上调miR-16表达能显著降低A549细胞活力及细胞克隆数目，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期于G1期，是通过靶向下调YAP1表达实现的。