含血管内皮生长因子缓释微粒的合成与鉴定

钟声 尚耀华 杨文峰 任远飞 董玉金 梁武 张铁慧 大连市中心医院手足外一科 （辽宁 大连 116033）

内容提要： 目的：合成含血管内皮生长因子缓释微粒，并检测其体外缓释作用。方法：本实验使用可降解高分子聚乳酸/乙醇酸共聚物，采用乳化分散法，对血管内皮生长因子进行包裹，制成可控制释放的微粒。测定VEGF体外释放情况并描绘成曲线。结果：制得VEGF的缓释微粒大小约80～120nm。体外释放检测开始时为快速释放期，随后为缓慢持续释放。结论：此实验证实成功构建含血管内皮生长因子缓释微粒。

血管吻合口处的血栓形成是术后最严重的并发症，也是困扰着显微外科医生的重大问题。血管内皮生长因子是一种具有诱导和刺激内皮细胞生长的多肽，对组织修复有重要作用。本实验使用可降解高分子聚乳酸/乙醇酸共聚物，采用乳化分散法，对血管内皮生长因子进行包裹，制成可控制释放的微粒。以求解决临床术后并发症，提高血管通畅度。

1.材料与方法

1.1 一般材料

试剂聚乳酸/乙醇酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）（大连市中心医院中心实验室提供）；兔抗人血管内皮生长因子多克隆抗体、VEGF-ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）。

主要试剂及仪器：二氯甲烷，丙酮，聚乙烯醇，沈阳化学试剂厂出品。

1.2 方法

微粒的合成与制备：称取1g聚乳酸/乙醇酸共聚物置于三口瓶中，加入20mL二氯甲烷和2mL丙酮，在800r/min的机械搅拌下滴加10mL兔抗人血管内皮生长因子多克隆抗体工作液，均匀乳化数分钟后，加入30mL含2%聚乙烯醇（Polyvinyl Alcohol，PVA）乳化剂的水溶液，搅拌2～3h。然后，在500mL的烧杯中，将上述乳化溶液倒入100mL0.3%的聚乙烯醇（PVA）水溶液中，以500r/min的速度搅拌24h，挥发除去二氯甲烷溶剂。

检测血管内皮因子缓释微粒大小：在旋转蒸发器中除尽有机溶剂，所得微粒在滤器上抽滤收集，使用激光粒度分析仪测量微粒的平均粒径。

微粒中血管内皮因子的体外释放的检测：随机称取相同重量的15个微粒样品（50mg），分别混悬在10mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）的降解介质中，在湿度l00%、37°C恒温箱中孵育，同时开始计时。在24h、48h、3d、5d、7d、15d、30d时分别吸取200µL上清液，同时补充等量释放介质。上清液行VEGF含量检测定量分析，并以时间为横坐标、VEGF累计释放量为纵坐标描绘VEGF的释放曲线。

2.结果

2.1 检测血管内皮因子缓释微粒大小

测试15份样本激光粒度分析仪测量微粒的粒径范围为83～121nm，平均直径为（104.25±17.03）nm。其中一份样本测量直径为53.27μm，考虑原因为多个微粒聚合而成，予以排除该样本。

2.2 微粒中血管内皮因子的体外释放的检测

1d时，微粒中的rhBMP-2释放量为15.54%，表现为爆发性释放，随后释放速度有所减慢，在第5d后又有一个快速释放期，但速度小于第1个快速释放期，第8d以后呈持续缓慢释放，第13d开始每日释放量明显减少，并波动不大，第20d开始无明显释放量，后连续监测10d维持于43.71%，连续监测30d最大累积值为43.71%（见图1）。

图1. VEGF累积释放曲线

3.讨论

小血管显微吻合术后吻合口处的附壁血栓形成是最严重的术后并发症[1,2]。有学者统计，即使是完善的术前设计、精细的显微操作及及时的术后处理，小血管显微吻合、组织游离移植的失败率仍然在百分之十。其可能的机制[3-5]主要是小血管吻合口处有内皮细胞的损伤或缺失，常导致红细胞、白细胞、血小板吸附聚集，当过多的血小板吸附与充填，最后导致血栓形成。吻合后血管与正常血管的最主要区别是缺乏内皮细胞覆盖。内皮再生后，可减少血栓形成并有效防止血管外漏。故内皮术后有效再生是预防血管吻合并发症的关键。

PLAG纳米载体具有极高吸附性，进入生物体内后释放药物可以短时间达到有效血药浓度并持续较长时间，缓释微粒能直接作用于靶细胞等优点。本实验所构成的载体使用激光粒度分析仪测量证实VEGF缓释微粒大小为80～120nm。与其他载体不同，缓释微粒具有2个快速释放阶段，从开始至第5d为第一个快速上升阶段，而后的3d为第2个快速上升相持续阶段，从第8d以后呈持续缓慢释放，第13d开始每日释放量明显减少，并波动不大，以后呈缓慢持续释放达20d。该实验结果显示VEGF缓释微粒体外良好的释放和缓释功能。

本实验已成功构建富含血管内皮生长因子缓释微粒，并体外释放鉴定，说明PLGA纳米粒是VEGF合适的缓释载体材料。同时也为下一步动物实验提供理论基础。