酸性离子通道3在膝关节骨性关节炎大鼠疼痛中的作用

季庆辉 乔建民 薛宇 刘士臣 乔晓峰 颜玉 李恒威

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

酸性离子通道(ASIC)3在骨性关节炎动物模型中发挥的作用和膝关节内注射APETx2是否有一定的止痛作用尚未可知。本文假设APETx2通过抑制 ASIC3直接作用在周围神经系统缓解疼痛。本研究分析ASIC3在大鼠骨性关节炎产生疼痛中的作用，探讨APETx2是否通过抑制 ASIC3缓解疼痛。

1 材料与方法

1.1动物 36只雄性大鼠8周龄，重约270 g。本研究经佳木斯大学动物伦理委员会同意。

1.2动物行为实验 动物行为实验在温度21～23℃和湿度40%～60%控制的房间内进行。

1.3骨性关节炎大鼠模型制备及分组 0.3 mol/L半胱氨酸液和4%木瓜蛋白酶液混合静止30 min，1、3、7 d分别在左膝关节腔内注入0.2 ml上述混合液行骨性关节炎造模。大鼠分为模型组、治疗组和对照组。对照组不造模，治疗组第3天、第1、2、3、4周，膝关节腔内注入50 μl APETx2。模型组只造模不应用其他药物。

1.4冯·弗雷长丝测试 应用von Frey刺激大鼠后爪，测定大鼠静态下后爪反射，将大鼠放钢丝网上30 min，并用有隔板的丙烯酸盒将每个大鼠分开，每个空间大小为8 cm×5 cm×10 cm。将von Frey垂直于足底后爪,直到von Frey表面弯曲，保持3 s或爪子撤回，说明对疼痛敏感。von Frey刺激强度10.0 g。机械敏感性测试：注射后1、3、7、14、21、28 d，对von Frey有反射表示有继发性疼痛。

1.5逆行标记膝关节传入纤维 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，然后膝关节剃毛，在左侧膝关节切5～6 mm长皮肤切口，将10 μl生理盐水稀释的固蓝B盐(FB)0.1 mg注入膝关节腔逆行标记。伤口用5-0丝绸固定。

1.6免疫组织化学 FB注射后7 d，所有大鼠被过量戊巴比妥钠(150 mg/kg)处死,摘除左侧L3～L5背根神经节(DRG)，检查FB分布情况。DRG被放置在4%多聚甲醛和30%蔗糖中过夜固定,石蜡包埋,-80℃保存。用低恒温切片机切10 μm切片放在载玻片上，暴露常温下干燥，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，5 min。10%羊血清37℃封闭60 min,兔血清抗-ASIC3孵育12 h后用PBS液冲洗5 min，3次,暗室中加山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G-异硫氰酸荧光黄(FITC)(1∶500)孵化2 h摇床振荡15 min 3次,封片。在Olympus BX-51(Olympus,Tokyo,Japan)显微镜下观察，并统计DRG中ASIC3阳性细胞平均百分比。

1.7统计学分析 使用SPSS21.0软件行多因素方差分析。

2 结 果

2.1冯·弗雷长丝测试实验 各组大鼠后爪对von Frey 10.0 g力发生的反应差异有统计学意义(P<0.01)。第3～28天，模型组和治疗组差异有统计学意义(P<0.05)；虽然第1天治疗组在APETx2注射后反射有所减少,但差异无统计学意义；对照组组和治疗组后爪反射相似。见图1。FB逆行标记膝关节传入纤维在DRG分布情况及ASIC3在各组DRG中免疫荧光的标记结果见图2。

与对照组比较：1)P<0.01；与治疗组比较：2)P<0.05图1 冯·弗雷长丝测试实验

图2 FB在DRG中逆向标记及ASIC3在DRG中的 免疫荧光标记结果(比例尺:100 μm)

2.2免疫组织化学检测结果 ASIC3阳性表达在L3～L5同侧DRG细胞中。对照组与模型组，ASIC3阳性细胞百分比差异有统计学意义〔(28.17±2.41)% vs (45.59±2.83)%,P<0.05〕,治疗组ASIC3阳性细胞百分比为(19.15±1.61)%，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

木瓜蛋白酶能分解关节软骨基质中蛋白多糖，加速蛋白多糖从关节软骨中丢失，改变关节软骨生物学特性，促进关节软骨退变进程。由于在大鼠关节腔注射木瓜蛋白酶容易复制骨性关节炎模型，通过4%木瓜蛋白酶膝关节腔注射方法，获得大鼠膝关节骨性关节炎模型。

前人研究显示，在后爪注射弗氏佐剂可引起急性炎症大鼠模型DRG细胞核中ASIC3 mRNA及蛋白质含量增加〔1〕。免疫测试数据与von Frey实验测试数据符合。APETx2注射膝关节腔，没改变骨性关节炎模型的原发性疼痛。ASIC3-/-大鼠后爪注射酸以及炎症反应不能引起机械性疼痛〔2〕。

APETx2通过干扰siRNA下调ASIC3水平可能发生在局部脊髓，不能明确APETx2在周围神经还是在中枢神经起作用。本研究表明ASIC3在骨性关节炎大鼠周围神经对疼痛控制中起到一定作用。继发性疼痛取决于激活ASIC3在初级传入纤维。研究显示在模型组和治疗组原发性疼痛没有区别，炎性疼痛、机械和热的疼痛,在ASIC3-/-和ASIC3+/+大鼠没有区别〔3〕。原发病灶周围ASIC3被激活后，疼痛信息通过周围神经传导到PRG，从而产生继发性疼痛，而对原发病灶疼痛不能发挥作用，表明ASIC3不会导致直接伤害感受器激活。本研究表明ASIC3能作为老年骨性关节炎引起继发性疼痛的靶点。