PI3k/AKT信号通路在老年大鼠乳腺癌血管形成中的作用及对整合素连接激酶ILK的抑制效果

曲义坤 国麟祺 夏伟滨 徐剑

(佳木斯大学附属第一医院普外科，黑龙江 佳木斯 154002)

乳腺癌是女性常见的一种恶性肿瘤，患者死亡率较高，近年来临床上呈现出显著上升趋势〔1〕。研究人员发现，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路在肿瘤当中存在失调问题，这一通路的成分突变会影响到通路功能，从而导致细胞的转化，一方面能够刺激肿瘤细胞数量的增殖，另一方面还会加速肿瘤细胞的转移侵袭。所以PI3K/Akt信号通路成为临床研究的热点问题，将这一信号通路当作关键靶点的乳腺癌靶向治疗受到人们的高度重视〔2～4〕。本研究分析老年大鼠乳腺癌血管形成中PI3K/AKT蛋白表达情况对整合素连接激酶(ILK)的抑制效果。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选择老年大鼠30只，设为对照组；另外选择老年大鼠30只，建立老年大鼠乳腺癌动物模型，设为观察组。入组60只老年大鼠检疫合格，体重30～68〔平均(45.2±1.3)〕g，12～18周龄，平均(15.1±0.3)w。动物合格证号：SCXK-(吉)2007-0003，所选动物均由医学动物实验中心提供SD大鼠常规饲养，自由摄食、饮水，光照12 h，建模前12 h禁食。本研究经过我院动物伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1动物模型建立 30只参与建模的老年大鼠，适应性1 w喂养后，将化学致癌剂二甲基苯蒽(DMBA)10 mg一次性灌胃后第2天开始，按照5 d为1个周期进行干预，连续干预12 w；第1～3天每天腹腔注射苯甲酸雌二醇(北京麦迪海药业有限责任公司，国药准字：H200000701)0.5 mg/kg，第4天腹腔注射黄体酮(上海现代制药股份有限公司，国药准字H31022328)4 mg/kg，停药1 d，从而完成老年大鼠卵巢癌动物模型建立。

1.2.2检查方法 (1)PI3K蛋白表达阳性率。①观察组建模成功后以断颈方式处死，取乳腺病灶组织，对照组同样以断颈方式处死，常规取乳腺组织。向选取的乳腺组织中加入蒸馏水与浓度为30.0%过氧化氢(H2O2)，常温下加入内源性酶并进行10 min灭活，磷酸盐缓冲液(PBS)连续洗涤3次。将最终获得的切片放置在0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中，加入生理盐水控制溶液pH最终为6。电炉加热直到煮沸，5 min间隔后再次煮沸，常温下冷却。采用PBS洗涤2次，每次5 min，最后加入5%胎牛血清(BSA)封闭液并加入兔抗人Ⅱ型胶原蛋白抗体，兔抗人PI3K、Akt蛋白一抗，1滴。滴加完毕后进行3次PBS洗涤；在1 ml底物中加入兔抗人PI3K、Akt蛋白二抗1滴，混合后常温下显色，苏木素复染后封片，倒置显微镜下观察细胞数量，每份标本测定3次，取平均值；②判断方法。参考奥尔雷德评分标准分别从细胞的阳性数量(阳性细胞数≤25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分)、染色强度(不着色0分，黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分)完成免疫组化染色评分，总分16分，分数越高，阳性率越高。(2)记录并统计观察组大鼠病理资料，包括：肿瘤直径、组织分型、淋巴结转移情况，分析不同病理资料下PI3K蛋白阳性率。(3)PI3K/Akt信号通路及ILK表达。采用Western印迹法测定软骨组织中PI3K/Akt信号通路及ILK表达水平。取两组乳腺组织，放入含有液氮的研磨器中研磨成粉末。向匀浆器中加入RIPA组织裂解液500 μl，待组织充分裂解后移到EP离心管1.5 ml中，10 min离心，离心速度12 000 r/min，离心完毕后留取上清，利用蛋白质定量试剂盒完成蛋白浓度测定并将其放置在-80℃冰箱。精确称取待测样品30 μg，加入6倍上样缓冲液，煮沸5 min使得蛋白充分变性，取上层清液，转移到EP管中，放入-20℃冰箱中，备用。对蛋白组织进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳、转膜后加入兔抗人PI3K/Akt信号通路及ILK一抗，4℃下孵育过夜后进行3次PBS清洗，加入二抗，常温下1 h振荡，3次清洗，每次10 min，加入显色液，在Tanon5200化学发光成像系统中成像。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0软件行χ2及t检验。

2 结 果

2.1两组大鼠PI3K蛋白及Akt蛋白表达阳性率比较 观察组PI3K蛋白(76.67%)及Akt蛋白(83.33%)表达阳性率显著高于对照组(16.67%，10.00%，χ2=6.892,P=0.029;χ2=5.718，P=0.031)。

2.2观察组大鼠不同病理下PI3K蛋白表达阳性率比较 观察组PI3K蛋白及Akt蛋白表达阳性率与性别无相关性(P>0.05)；观察组老年乳腺癌大鼠中PI3K蛋白及Akt蛋白表达阳性率在不同肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移情况中差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 观察组大鼠不同病理下PI3K及 Akt蛋白表达阳性率比较(n)

2.3两组PI3K/Akt信号通路及ILK表达比较 观察组PI3K/Akt信号表达水平显著高于对照组(P<0.05)；观察组乳腺癌大鼠ILK信号表达水平显著低于对照组(P<0.05)，见图1。

图1 两组PI3K/Akt信号通路及ILK表达

3 讨 论

PI3K是生物细胞膜必不可少的组成部分之一，作为转导分子参与到细胞调节的过程。PI3K对于激活肿瘤细胞的生长及抗凋亡等领域，都有着一定程度的影响〔5〕。PI3K家族的研究较多，根据其结构能够进一步分成Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型，每型又能够进一步分成不同亚型。目前，研究最为普遍的是可以被细胞受体激活的PI3KⅠ型，包括ⅠA及ⅠB两个亚型〔6〕。ⅠA型PI3K是催化亚基P110及P85联合组成的异二聚体。PI3K能够同连接蛋白以及生长因子受体互相作用，从而改变二聚体构象将其激活。PI3K还能够同Ras蛋白及P110的结合，激活结果是在质膜上生成PIP3，PIP3同细胞当中的信号蛋白Akt及磷酸肌醇蛋白激酶(PKD)1进行结合，Akt还可以借助于PKD2(例如ILK)对其磷酸化诱发的Akt彻底活化〔7〕。只有Akt的Thr307及Ser473都彻底磷酸化之后才可以有效发挥功能。Akt是苏氨酸激酶的一种，包括480个氨基酸残基，同蛋白激酶(PK)A及PKC高度同源，属于主要的PI3K下游效应分子〔8〕。Akt分子的氨基酸结果方面主要包括催化结构域、PH结构域及羧基端结构域。其中PH结构域包括氨基酸残基100个，能够介导Akt活化之后的膜转位〔9〕。催化结构域当中包括ATP位点，结构域当中的Thr308的磷酸化是Akt活化必不可少的。目前研究人员发现Akt成员包括Akt1/PKBa、Akt3/PKBg及Akt2/PKBb 3种不同的亚型，包括3种不同的基因编码，不过蛋白质结构类似，在各种器官组织当中广泛表达。Akt激活之后，从细胞膜逐渐转移到细胞核及细胞质，能够借助于磷酸化抑制或者是激活下游靶蛋白，从而影响到细胞凋亡、增殖或者是迁移〔10〕。PI3K/Akt信号通路受各种因素的影响，负反馈主要由染色体丢失性的蛋白抑癌基因，阻断Akt及效应分子的活化。本研究结果提示PI3K/Akt同老年大鼠乳腺癌血管生成有重要的影响。检测乳腺癌组织以及正常乳腺组织当中的PI3K/Akt表达水平，并且分析其同临床病理指标间的联系，可以为乳腺癌早诊断以及早治疗提供参考依据〔11〕。

PI3K/Akt信号通路的抑制剂能够在一定程度上抑制VEGF生成与分泌，还能给抑制血管的增殖。PI3K/Akt信号通路可以激活Akt，后者则可以激活底物雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)，磷酸化mTOR并且借助于失活结节性复合物2(TSC2)来加速mTOR磷酸化〔12〕。PI3K/Akt信号通路的抑制剂能够防止因为mTOR抑制而出现的Akt激活，有着重要的应用价值。LY294002及青霉素是常规的PI3K/Akt通路抑制剂，能够抑制PI3K通路P110亚基活性，从而阻断信号通路，抑制肿瘤血管增殖及肿瘤生长，不过因为毒性较强而影响到临床应用〔13〕。雷帕霉素是新出现的一种mTORC1抑制剂，能够在抑制血管内皮生长因子(VEGF)的过程当中同时抑制血管生成及细胞增殖。同雷帕霉素比较而言，0SI-027及OXA-I能够发挥双重抑制效果，所以PI3K/Akt信号通路的抑制剂同VEGF抑制剂联合使用可以发挥肿瘤血管形成的抑制效果〔14〕。ILK是一个有着3个结构单位的蛋白激酶，并且在N端有着4个重复的锚蛋白序列，接下来是磷酸肌醇基序，C端则是整合素的结合位点〔15〕。ILK活性程度受H3K活性水平的影响，推测其调控作用机制是H3K的生成物PIP3可以借助于磷酸肌醇结合基序来同ILK实现结合〔15〕。活化之后的ILK磷酸化蛋白激酶(pPK)B与糖原合成酶激酶(GSK)3能够使它们激活同时发挥生物学作用。乳腺癌组织当中的ILK呈现为棕黄色的颗粒，定位在肿瘤的细胞质及细胞膜当中，同时阳性物质集中分布在肿瘤细胞，部分分布在肿瘤问质，间质当中主要是成纤维细胞、巨噬细胞及内皮细胞的着色〔16〕。乳腺癌当中的ILK表达同组织学分级及淋巴结转移存在显著相关性。ILK蛋白在乳腺癌组织当中的表达要显著高于癌前病变组织，表明ILK同乳腺癌病情的发生发展存在不容忽视的重要联系，可以刺激乳腺癌的转移以及侵袭〔17〕。ILK在人类的肺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌及黑色素瘤等组织当中均呈现为高表达，并且表达程度同恶性程度存在显著正相关〔18〕。ILK高表达细胞在培养过程当中并不贴壁生长，能够抑制悬浮细胞的凋亡，在裸鼠当中成瘤ILK借助于Ser473来激活PKB，从而影响到细胞的正常死亡〔19〕。PKB抑制细胞的死亡是借助于一系列的效应物实现的，主要包括磷酸化的bcl-2及失活的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)9。借助于过磷酸化还可以抑制forkhead转录因子及FAS配体表达。活化之后的PKB磷酸化Ser9能够抑制GSK3活性程度使得细胞核当中的cyclinD1持续累积，从而刺激细胞周期进行。借助于抑制GSK3活性可以降低13-连接蛋白的降解。GSK3的下游效应物是AP-1转录因子的组成元件，GSK3虽然可以对其DNA结构域磷酸化，使其无法顺利同DNA进行结合。对GSK3活性程度的抑制影响到磷酸化进程，诱导凋亡蛋白(AP)-1活性。研究人员发现，GSK3活性是细胞及细胞外基质依赖ILK及PI3K来发挥抑制效果的，与此同时，这种抑制对于胞外基质的AP-1活性也有重要的影响〔20〕。细胞及胞外基质之间的互相影响诱导ILK活性，ILK则可以抑制GSK3活性水平。GSK3活性的降低刺激AP-1启动子序列结合，活化AP-1转录因子。本研究结果提示，ILK抑制对于影响老年大鼠乳腺癌血管细胞有显著的效果。