依达拉奉对蛛网膜下腔出血大鼠海马区神经元自噬及凋亡的影响

刘瑶 刘俊杰 吴寅秋 吴娟 杜鹃 王雪 李建民 赵雅宁

(华北理工大学 1护理与康复学院，河北 唐山 063000；2临床医学院)

依达拉奉作为一种有效的自由基清除剂，通过抑制羟基自由基依赖性和自由基非依赖性的过氧化脂质的产生发挥抗氧化剂的作用〔1〕。依达拉奉作为一种神经保护剂，除了能降低自由基的浓度外，还有抗脑水肿及神经保护功能，现已逐步应用到蛛网膜下腔出血(SAH)的治疗过程中。SAH是临床上一种常见的脑血管疾病，多见于创伤和脑动脉瘤破裂〔2〕，在急性脑血管病中大概占10%，发病率和死亡率超过50%〔3〕，已经成为人类致残、致死的主要疾病之一。目前研究证实，SAH后尽早地减少出血后神经细胞凋亡数目，降低死亡率，是治疗关键〔4〕。SAH后产生大量自由基，引起凋亡信号被激活，介导细胞凋亡的过程，造成脑组织不可逆损害。低水平的自噬可以减轻细胞凋亡，减轻SAH后早期脑损伤〔5〕。但依达拉奉在SAH后对神经细胞凋亡的作用机制是否与自噬有关还不清楚。本实验拟从自噬层面上探讨依达拉奉对SAH后神经元凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 依达拉奉(南京先声东元制药有限公司，国药准字H20050280)；3-甲基腺嘌呤溶液(上海伟进生物科技有限公司)；多克隆Beclin-1、LC3-Ⅱ抗体(SantaCruz公司)；二抗及显色用品(美国KPL公司)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白质定量试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)；石蜡切片机(德国LEICA)。

1.2分组及模型制作 清洁级雄性SD大鼠24只，体质量350～450 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。用随机数字表法将大鼠分为4组：假手术组、SAH组、3-甲基腺嘌呤组(3-MA组)和依达拉奉组(Edr组)，每组6只。参考文献〔6〕采用血管穿刺法制备大鼠SAH模型。大鼠称重后使用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，采取颈部前正中切口，夹闭颈总动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉，剪断其远心端，将尼龙线斜插入颈内动脉，到达颅内。造模成功参考指标：手术中出现呼吸急促，心率加快；麻醉清醒后精神萎靡，嗜睡、畏光等。大鼠麻醉清醒后以5 mg/kg剂量、通过腹腔注射法注射相应溶剂，即SAH组注射生理盐水、3-MA组注射3-MA溶液、Edr组注射依达拉奉。假手术组手术操作与SAH组相同，但不刺破大脑血管，联合腹腔注生理盐水。

1.3HE染色 术后24 h，10%水合氯醛深度麻醉大鼠后打开胸腔，经心脏灌注生理盐水至大鼠肝脏发白，随后改用4%多聚甲醛灌注，断头取脑，置于甲醛溶液内保存。纵切取视交叉至大脑横裂区域脑组织，行常规石蜡包埋、切片(片厚5 μm)、HE染色，脱水封片。光镜下观察海马CA1区细胞的病理变化。每只大鼠取3张切片，每张切片在海马CA1区随机取5个独立视野，计算存活与死亡细胞数并得出均值。

1.4免疫组织化学染色 行常规脱蜡水化，过氧化氢避光孵育10 min，胰酶抗原修复20 min，滴加Beclin-1多克隆抗体(1∶200稀释)、LC3-Ⅱ多克隆抗体(1∶300稀释)置于湿盒中4℃冰箱过夜；第二步滴加二抗置于37℃温箱孵育30 min，经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，行二氨基联苯胺(DAB)显色、脱水、透明、封片。实验采用PBS代替一抗，作为阴性对照。光镜下观察海马CA1区阳性细胞的表达情况。每只大鼠取3张切片，每张切片在海马CA1区随机取5个独立视野(400×)，计算阳性细胞数并得出均值。

1.5细胞凋亡检测 切片进行常规脱蜡、预处理组织后，使用过氧化氢室温封闭10 min；PBS洗涤，随后滴加平衡缓冲液，风干多余液体立即滴加工作强度转移酶充分覆盖组织，并置于湿盒中温箱孵育1 h，加入停止/洗涤缓冲液；最后滴加抗地高辛氧化酶经室温孵育30 min后，滴加DAB显色、脱水、透明、封片。光镜下TUNEL阳性产物主要位于细胞核。每只大鼠取3张切片，每张切片在海马CA1区随机取5个独立视野，计算阳性细胞数并得出均值。

1.6统计学分析 应用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析和SNK检验。

2 结 果

2.1CA1区神经细胞观察 假手术组海马区神经元镜下形态规则、分层排列整齐，胞质均匀，胞核界限清晰，核仁明显；SAH组海马区神经元镜下形态呈不规则锥形、交错排列，核膜裂解、核固缩和溶解、核仁消失；相比于SAH组，3-MA组病理损伤明显增重，损伤神经元数量增加、核固缩和核溶解明显加重；相比于SAH组，Edr组细胞损伤明显减轻，损伤神经元数目减少，核固缩、核碎裂和核溶解现象明显减轻，但较假手术组损伤依然严重。见图1、表1。

2.2细胞凋亡检测 TUNEL检测发现凋亡细胞形态学特征示胞体缩小，染色质凝集，密度增高，胞核中棕色颗粒。SAH组凋亡细胞数量显著增多(P<0.05)；相比于SAH组，3-MA组凋亡细胞数显著增加(P<0.05)，Edr组凋亡细胞数显著降低(P<0.05)，但仍高于假手术组(P<0.05)。见表1。

2.3免疫组织化学染色 假手术组镜下视野未见阳性细胞或个别散在分布，Beclin-1、LC3-Ⅱ和Caspase-3均不表达或极低水平表达；相比于假手术组，SAH组Beclin-1、LC3-Ⅱ和Caspase-3蛋白阳性细胞明显增加(P<0.05)；相比于SAH组，3-MA组Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白阳性细胞显著减低，但仍显著高于假手术组(P<0.05)，而3-MA组Caspase-3蛋白阳性细胞明显增加(P<0.05)，Edr组Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白阳性细胞升高(P<0.05)，而Caspase-3蛋白阳性细胞明显降低(P<0.05)；相比于3-MA组，Edr组Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白阳性细胞升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白阳性细胞明显降低(P<0.05)。见表2，图2。

图1 各组神经元细胞染色(HE，×400)

组别存活细胞数凋亡细胞数假手术组122.17±2.4814.00±2.53SAH组73.33±1.971)63.50±2.431)3-MA组69.50±2.352)67.17±2.861)2)Edr组85.17±2.401)2)51.50±1.641)2)

与假手术组比较:1)P<0.05；与SAH 组比较:2)P<0.05

表2 各组海马CA1区Beclin-1、LC3-Ⅱ、Caspase-3 阳性 细胞数的比较个/HP,n=6)

图2 各组海马 CA1 区Beclin-1、LC3-Ⅱ、Caspase-3染色(DAB，×400)

3 讨 论

SAH发病初期病死率约为40%，30%的幸存者会遗留严重神经功能障碍〔7〕。SAH后通常会出现的并发症是脑血管痉挛，是造成患者死亡常见的原因之一。SAH 发生后血凝块溶解释放的氧合血红蛋白，会产生大量活性氧自由基和脂质过氧化物，诱导自由基反应，引起和加重脑血管痉挛〔8〕。随着对SAH研究的进展，大多数入院的患者不会再次出血，由于早期脑损伤的分子机制及信号通路十分复杂，尚未找到一种有效手段可以预防或减轻脑组织细胞的早期损伤。作为经典的氧自由基清除剂，依达拉奉能改善皮质水肿、可抑制脂质过氧化、有效消除自由基；因此，临床上被用作急性脑缺血神经保护剂；近年来，其已逐渐用于SAH的早期治疗。在SAH治疗的过程中，依达拉奉以其强大的自由基清除功能及抑制脂质过氧化反应，起到防治脑血管痉挛，发挥脑保护作用〔9〕。本研究提示依达拉奉具有减轻SAH所致细胞凋亡的作用。

细胞自噬是真核生物中一种进化上高度保守的、细胞内成分和结构更新的正常途径，调控蛋白和细胞器的降解利用，参与细胞质的重建，是保持完整细胞器和大分子蛋白降解的主要途径，因此自噬在维持细胞的自我稳态、适应内外环境的变换及自身发育方面发挥着重要作用。自噬在神经系统的调控作用与疾病的发生发展密切相关〔10，11〕。Lee等〔12〕在大鼠SAH模型上发现受损的神经元中Beclin-1、LC3-Ⅱ均表达升高，提示自噬可能参与自发性SAH后的早期脑损伤。且有研究证实自噬激活在SAH后早期脑损伤的发生发展过程中引起神经元凋亡中发挥关键作用〔13〕。本研究结果显示，依达拉奉可能是通过促进自噬的表达，对海马区神经元的凋亡起到了一定的抑制作用。自噬和凋亡作为细胞死亡的两种形式，二者之间有复杂的联系〔14〕。自噬可清除破损线粒体，可能在一定程度上延迟了凋亡的发生，且起到对抗凋亡的作用〔15〕。本实验从自噬层面上证实了依达拉奉有效的干预能激活自噬，减少细胞凋亡，起到神经保护作用。