结直肠癌中HMGA2表达的意义与微卫星不稳定性的关系

兴成娟 陈素贤 李伦 万义增

(1锦州医科大学，辽宁 锦州 121000；2锦州医科大学附属第三医院病理科)

结直肠癌早期无明显症状，大多数患者发现时已是中晚期，其治疗主要以外科手术为主，辅以放化疗，但效果往往不尽如人意。微卫星不稳定性(MSI)是结直肠癌的发病机制之一，大约占15%散发性结直肠癌的发病病因〔1〕。MSI由错配修复基蛋白(MMR)缺失造成。目前，主要应用于临床检测的MMR蛋白包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2。高迁移率族蛋白(HMGA)2是近年发现的与肿瘤发生、浸润、转移有密切关系的DNA结合蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中均有表达〔2〕。本文探讨HMGA2与MSI的相关性及与结直肠癌患者临床病理参数之间的关系。

1 材料与方法

1.1研究对象 取自2015年9月至2016年12月锦州医科大学附属第三医院病理科结直肠癌手术新鲜标本及对应常规石蜡70例，年龄46～72岁，平均59岁，配对正常肠黏膜(距癌5 cm以上)新鲜组织及对应常规石蜡20例。均经病理学诊断给予证实。研究对象具有完整病例，均为原发肿瘤，术前未经抗肿瘤治疗。

1.2主要试剂 兔抗人HMGA2多抗购自英国Abcam公司；即用型鼠抗MLH1、MSH2、MSH6和PMS2单抗均购自福州迈新生物技术开发有限公司；免疫组化二抗pv9000试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司；RAPI组织裂解液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；Western印迹其他相关试剂购自碧云天生物技术研究所。

1.3方法

1.3.1免疫组化 HMGA2一抗稀释浓度为1∶200，抗原修复液使用pH8.0 EDTA，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照，乳腺癌组织作阳性对照，实验步骤按照说明书操作。结果判定：双盲法由两位病理医师根据阳性细胞染色强度及阳性细胞占所有细胞百分比乘积双向评估，HMGA2细胞核无染色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分，阳性细胞百分比≤5%为0，6%～25%为1，26%～50%为2，51%～75%为3，>75%为4，乘积0为阴性，1～3为弱阳性表达，4～8为中等阳性表达，9～12为强阳性表达〔3〕。无表达和弱阳性表达归为弱表达，中等阳性及强阳性表达归为强表达。MSI结果判断：MLH1、MSH2、MSH6和PMS2均以肿瘤细胞核部分或全部出现棕黄色染色为阳性表达，若MLH1、MSH2、MSH6和PMS2均为阳性表达，则判定为微卫星稳定(MSS)，若其中任何一个指标阴性表达，则判定为低频微卫星不稳定(MSI-L)，若其中任何≥2个指标阴性表达，则判定为高频微卫星不稳定(MSI-H)，肠癌组织做阳性对照。

1.3.2Western印迹法 以总蛋白提取试剂盒说明为准在新鲜标本中提取总蛋白，BCA法定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，PVDF转膜，HMGA2一抗稀释浓度1∶2 000，增强化学发光法(ECL)显影，Image J软件对条带进行灰度分析，β-肌动蛋白(β-actin)为内参，重复试验三次，计算蛋白表达水平。

1.4统计学分析 采用SPSS17.0软件进行χ2检验、方差分析或t检验。

2 结 果

2.1免疫组化结果

2.1.1HMGA2在结直肠癌组织和正常肠黏膜组织中的表达 HMGA2阳性表达主要位于细胞核内，呈现棕黄色或棕褐色细颗粒状染色，见图1。HMGA2在70例结直肠癌组织中的阳性率为65.71%(46/70)，而在20例正常肠黏膜组织中不表达或弱表达，两组比较差异显著(χ2=26.883，P=0.000)。

图1 HMGA2在正常肠黏膜与结直肠癌组织的表达(DAB，×200)

2.1.2HMGA2在结直肠癌中的表达与临床病理参数间的关系 HMGA2的表达与肿瘤分化程度和患者远处转移有关。在高、中、低分化癌组织中HMGA2的阳性率差异有统计学意义(P=0.039)；发生远处转移的HMGA2的表达率与无远处转移的表达率差异有统计学意义(P=0.007)，见表1。

2.1.3结直肠癌中MSI的检测结果 通过检测MSI相关蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达，判定为MSI-H组12例，发生率为17.14%(12/70)，MSI-L组7例，发生率为10.00%(7/70)，MSS组51例，发生率为72.86%(51/70)(图2)。其中年龄46～59岁MSI-H发生率显著高于60～72岁(P=0.044)；MSI-H右半结肠发生率与左半结肠发生率差异有统计学意义(P=0.023)。此外，MSI-H发生与肿瘤分化高低关系密切(P=0.016)。见表1。

表1 HMGA2、MSI与结直肠癌临床病理参数之间的关系(n)

图2 MSI相关蛋白表达(DAB，×200)

2.1.4HMGA2在MSI-H组、MSI-L/MSS组的表达情况 MSI-H组HMGA2阳性率为41.67%(5/12)，MSI-L/MSS HMGA2阳性率为70.68%(41/58)，两组比较差异无统计学意义(χ2=2.531,P=0.111)。

2.2Western印迹结果

2.2.1HMGA2蛋白在结直肠癌组织和正常肠黏膜组织中的表达量 HMGA2蛋白条带在分子量12 kD处显影，内参β-actin蛋白条带在分子量43 kD处显影。经软件统计分析，HMGA2的蛋白表达量在正常肠黏膜和结直肠癌分别为(0.069±0.025)、(0.447±0.098)，差异显著(t=-50.297，P<0.001)，见图3。

图3 不同分组中HMGA2蛋白的表达量

2.2.2HMGA2蛋白表达量与肿瘤分化及临床分期的关系 高分化组、中分化组、低分化组HMGA2的蛋白表达量分别为(0.393±0.079)、(0.444±0.093)、(0.503±0.097)，表达呈上升趋势，两两比较差异均有统计学意义(F=16.571，P<0.05)，见图4。TNMⅠ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期的表达量分别为(0.442±0.095)、(0.501±0.094)，差异有统计学意义(t=-3.000，P<0.05)，见图5。

图4 不同分组中HMGA2蛋白的表达量

图5 不同分期中HMGA2蛋白的表达量

3 讨 论

本实验结果提示临床检测HMGA2可预测肠黏膜病变情况。通过分析HMGA2与临床病理资料的相关关系，发现癌组织分化程度越低、临床分期越晚则HMGA2表达越高，说明HMGA2阳性表达与结直肠癌恶性程度相关，提示HMGA2可能参与促进结直肠癌的发生及恶性趋势转变过程。但本研究结果与前人研究〔4〕结果存在差异。Wang等〔4〕研究发现HMGA2仅在发生远处转移的结直肠癌组织中差异表达，而与患者年龄、性别、肿瘤分级、位置、浸润深度、淋巴结转移和临床分期均无关，与徐广甍〔3〕、Rizzi等〔5〕报道一致。高小平〔6〕研究表明，结直肠癌肿瘤浸润深度越深，分化程度越差及TNM分期越晚，有淋巴结转移则HMGA2表达越高，亦说明HMGA2在结直肠癌的发生及进展过程中具有重要的促进作用。各组研究结果不尽相同的原因可能是样本来源的地域、种族、肿瘤异质性及样本数量有所不同而造成差异。

MSI是目前临床上用于判断结直肠癌预后及指导治疗的重要指标，多项研究指出MSI结直肠癌患者存在相对独特的临床特征，但报道不一仍存在争议。本研究结直肠癌MSI发生率低于李新霞等〔7〕研究数据，其中MSI-H发生率17.14%，与大量报道的平均值较为接近。Fujiyoshi等〔8〕对2 219例结直肠癌患者进行研究，发现MSI-H好发于女性，近端结肠多于远端结肠，黏液腺癌多较见，与年龄、肿瘤大小、TNM分期均相关，与Kim等〔9〕研究相似。本实验显示，MSI-H好发生于右半结肠，与年龄及肿瘤分化程度有关，与Ismael等〔10〕研究结果一致。本研究结果可为临床个体化、精确化治疗提供借鉴。造成实验结果不同的原因可能是因为目前MSI的检测方法没有统一标准，可采用聚合酶链反应(PCR)检测，也可用免疫组化检测，或是选择研究对象存在偏倚，从而影响实验结果。

错配修复蛋白缺失及肿瘤细胞中某些基因突变是MSI发生的重要原因。研究发现，人类结直肠癌MSI的发生与激活转化生长因子(TGF)-β/Smads信号通路中的转化生长因子受体关系密切〔11,12〕。本研究说明HMGA2的表达与微卫星状态无关，提示HMGA2可能通过TGF-β/Smads信号通路之外的其他途径发挥作用。最近研究表明，HMGA2作为启动子结合到白细胞介素(IL)11的-2147/-2132区域并激活转录，通过STAT3信号途径诱导肿瘤侵袭转移〔13〕，间接证明了我们的观点。

总之，HMGA2在肿瘤形成及进展中发挥重要作用，HMGA2及MSI在结直肠癌中作用及相关性的研究还处于组织阶段，后期将对其进行细胞学研究，对二者的深入研究能为结直肠癌的发病机制提供更多的理论基础，为结直肠癌的筛查、治疗寻找新的标靶。