羊水细胞染色体核型分析结合CMA在孕妇产前诊断中的应用分析

曾研章

广东省阳江市妇幼保健院，广东阳江 529500

产前诊断在预防出生缺陷胎儿中是一条主要的途径，羊膜腔穿刺羊水细胞染色体核型分析是用于产前诊断染色体异常的“金标准”，对于非整倍体的检出率较高，对于10Mb及以上的缺失或重复、胎儿染色体数目异常和结构异常均可作出全面的分析[1]。染色体微阵列分析（CMA）对于出生缺陷、出生畸形与智力低下都有显著的评估价值[2]。基于此，本研究选择2018年4月～2019年3月我院行产前诊断的126例孕妇为研究对象，所有孕妇均接受羊水细胞染色体核型分析，同时接受CMA分析，进一步探讨羊水细胞染色体核型分析结合CMA用于产前诊断的价值，现报道如下。

表1 非整倍体异常检测结果

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年4月～2019年3月我院行产前诊断的126例孕妇为研究对象，所有孕妇均自愿接受羊水细胞染色体核型分析和CMA检测，均至少满足以下一个产前诊断指征[3]：（1）35岁及以上高龄孕妇；（2）超声异常，如羊水过多、羊水过少、胎儿超声软标记（胎儿颈项透明层增厚NT≥3mm、双侧脉络丛囊肿、侧脑室轻度增宽等）、胎儿发育异常、可疑畸形、严重先天性心脏病、胎儿水肿等；（3）不良妊娠史或夫妻中的一方有家族遗传病史；（4）孕早期不良接触史；（5）产前母血清经筛查判定为高风险，或经无创性产前检测（NIPT）判定为高风险或临界风险；（6）经无创产前基因检测显示异常，如提示可疑染色体微缺失或重复，可疑21、18和13以外的其他染色体异常者。孕妇年龄22～45岁，平均（32.4±3.3）岁，孕周12～35周，平均（22.4±5.2）周，本研究获得医院伦理委员会批准，所有孕妇及家属均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 染色体核型分析：培养基、秋水仙素、KCL溶液、植物血细胞凝集素、胰蛋白酶液、甲醇、冰乙酸、NaOH溶液、细胞培养箱、生理盐水均由南京道斯夫生物科技有限公司提供、全自动染色体分析仪（美国贝克曼库尔特）、Giemsa染色液（上海素尔生物科技有限公司），CMA检测（Affymetrix公司）：DNA提取试剂盒、微阵列芯片、OMIM、ISCA、DGV、UCSC等数据库查询数据。

1.2.2 方法 （1）羊水细胞染色体核型分析：常规消毒后在超声引导下进行羊膜腔穿刺术抽取25mL羊水，分别置入3支无菌离心管，经1400r/min离心10min，去除上清液并加入羊水培养基制备细胞悬液，按照三线接种在培养瓶中，放入5%二氧化碳培养箱37℃培养，7 ～ 8d换液，培养10d左右根据细胞的生长情况收获，常规制片，CTG-胰酶显带，在显微镜下进行染色体核型分析，30个分裂相计数，分析5个核型，存在异常核型时增加计数量。（2）CMA检测：羊水10mL送检，微阵列芯片为Affymetrix公司提供，按照Affymetrix公司流程进行检测，微阵列芯片包含200 000 SNP标记与550 000 CNV标记，1个标记平均4kb密度分布在人类整个基因组（非全染色体基因组所有位点），对全基因组中有临床意义的染色体微缺失、微重复、染色体拷贝数变化、杂合性缺失进行检测。通过在线公共数据库、医院数据库进行数据分析。

2 结果

2.1 胎儿染色体非整倍体异常

CMA检测显示胎儿染色体非整倍体异常与羊水细胞染色体核型分析结果一致，无差异，见表1；且所有染色体非整倍体异常均检测出，并且对于核型分析无法确定异常片段来源与性质的，CMA检测显示了DNA水平的精细结果，其中47，XN，+mar病例无法确定的标记染色体，经CMA检测确定为22号染色体22q11.1q11.21区段有1.7Mb片段的2次重复，显示胎儿为额外idic（22）（q11.2）标记染色体携带者。同时，CMA检测还能够检测出额外的、具有临床意义的基因拷贝数，如21-三体综合征的1例胎儿1号染色体1q21.1q21.2区段存在1.8Mb片段重复，含OMIM基因13个。但CMA检测无法发现胎儿染色体结构异常，如21-三体综合征的1例胎儿，染色体核型为47，XN，+21，der（21：21）（q10：q10）。

2.2 胎儿染色体不平衡变异

经羊水细胞染色体核型分析显示3例胎儿染色体不平衡易位，对胎儿父母外周血染色体核型进行分析显示，其中2例为平衡易位携带者，另1例经高分辨率染色体核型分析显示父亲18号染色体臂间倒位。染色体不平衡变异均来源于遗传。经CMA检出染色体不平衡变异与染色体核型分析结果相同，并且更加精确的作出异常定位，显示亚显微水平的微缺失与微重复。见表2。

2.3 胎儿染色体嵌合体异常

经染色体核型分析显示，2例胎儿染色体嵌合体异常，其中1例显示为低水平嵌合，CMA检测无法完全检出，另1例染色体核型分析结果与CMA检测一致，并且CMA检测显示出更为精确的异常位点，见表3。

2.4 羊水细胞染色体核型分析正常但CMA异常的结果

经羊水细胞染色体核型分析显示有3例正常胎儿经CMA检测为异常，检出拷贝数变异片段大小为496.8kb、827.2kb、16.7Mb，见表4。经多个数据库的分析显示，片段内涉及的OMIM基因均与胎儿表型疾病相关，因此本次受检孕妇中3例羊水细胞染色体核型分析正常但CMA异常的胎儿拷贝数具有致病性，CMA技术检出率比羊水细胞染色体核型分析提高2.38%（3/126）。

表2 胎儿染色体不平衡变异检测结果

表3 胎儿染色体嵌合体异常检测结果

表4 羊水细胞染色体核型分析正常但CMA异常的结果

3 讨论

产前诊断的对象主要为35岁以上的高龄产妇，以及母血清学筛查高风险、产前超声异常的孕妇等[4]，染色体核型分析技术与细胞培养均是传统的产前诊断方式，但羊膜腔穿刺是一种有创操作，孕妇的接受度较差，因此产前诊断医师对于羊膜腔穿刺指征的明确非常重要[5]。染色体微阵列分析（CMA）也被称为染色体分子核型分析或基因芯片技术，包括有单核苷酸多态微阵列（SNP array）和比较基因组杂交微阵列（array CGH）[6]，可对全基因组进行精确、高分辨率的染色体微缺失与微重复的检测，与羊水细胞染色体核型分析相比，其优势在于高分辨率、高通量、高自动化检测，并且能够对许多和先天性疾病与出生缺陷相关的基因组异常进行一次同步检测[7]。

本研究以126例孕妇为研究对象，探讨羊水细胞染色体核型分析结合CMA用于产前诊断的价值。结果显示：（1）CMA技术用于产前诊断的有效性和准确性更高，对于染色体核型正常的CMA检测可发现有基因拷贝数变异。经羊水细胞染色体核型分析共检测出胎儿染色体非整倍体异常12例，CMA检测结果与之相同尽管CMA检测无法发现胎儿染色体结构异常，但21三体综合征的检测是准确有效的，对于核型分析无法确定来源与性质的异常片段，CMA能够进行DNA水平的精细分析而获得更为准确的结果，如22号染色体为额外idic（22）（q11.2）标记染色体携带者，涉及猫眼综合征关键区域[8]，结果提示，CMA技术对于染色体核型分析可检测到的变异，可精确地鉴定核型中未知额外的染色体内容和来源，对于遗传咨询临床解决决定具有指导意义[9-10]。（2）CMA检出染色体不平衡变异与染色体核型分析结果相同，CMA技术可以更加准确地反映变异区带、变异类型、基因数目，显示亚显微水平的微缺失和微重复，信息更加全面[11]。（3）经染色体核型分析共检测出胎儿染色体嵌合体异常2例，1例由于低水平嵌合，CMA检测无法完全检出，但对于高比例的嵌合体，CMA检测显示出更为精确的异常位点，Xp22.33q11.1区段61.7Mb片段缺失。结果提示，CMA对未培养的细胞检测具有优势，培养后的嵌合情况由于正常细胞生长比异常细胞更具有优势而降低，因此不容易检出[12]，在嵌合体检出核型分析中还需要结合基因芯片。（4）羊水细胞染色体核型分析正常但CMA异常：由于CMA技术一次可同时对几十万甚至上百万的DNA片段进行检测，无论这些片段有无临床意义，与个体变异有无关系均可检测[13]，结合数据库的应用明确基因拷贝数内包含疾病的相关突变，以及基因致病突变的性质[14]。本次结果中经羊水细胞染色体核型分析显示有3例正常胎儿经CMA检测为异常，检出拷贝数变异片段大小为496.8kb、827.2kb、16.7Mb，通过基因型-表型分析，判断为致病拷贝数，1例全前脑。唇腭裂临床表型包括眼部异常、小脑发育不良；1例15号染色体增多临床表型为智力障碍、脑发育异常；1例NT增厚缺失片段与智力障碍与身材矮小有关[15]。

综上所述，CMA技术在孕妇产前诊断中的有效性和准确性更高，临床上可以结合两种检测方式提高胎儿出生缺陷的检出率。