PDCD4和Clusterin在卵巢上皮性癌中的表达及其临床意义

陈海伦 罗幸波 宏小翠 杨海霞 易智君

1.广东省惠州市中心人民医院 中山大学附属惠州医院妇产科，广东惠州 516001；2.广东医科大学附属医院肿瘤中心，广东湛江 524001；3.广东省惠州市中心人民医院 中山大学附属惠州医院病理科，广东惠州 516001

卵巢癌为目前高发的女性生殖道三大常见恶性肿瘤之一，和其他类型的恶性肿瘤一样，卵巢癌发生、发展是极其复杂的过程，涉及多基因、多步骤、多阶段等因素[1-5]；程序性细胞死亡因子4（PDCD4，Programmed cell death 4）是一种近期发现的新型肿瘤抑制基因并且与细胞凋亡相关，与多种肿瘤的发生、侵袭、转移发展关系密切[6-8]；Clusterin是新近发现的一种凋亡相关因子，具有细胞保护功能的作用，广泛存在于人类和动物的多种组织中，其异常表达与多种肿瘤的发生、发展相关[9-11]；本研究采用免疫组化法检测PDCD4及Clusterin在卵巢上皮性癌组织中的表达情况，探讨PDCD4和Clusterin与卵巢上皮性癌发生、发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月～2019年1月惠州市中心人民医院（中山大学附属惠州医院、广东医科大学惠州临床医学院）以及广东医科大学附属医院门诊活检或者住院手术病理标本共95例，均为女性患者标本；其中35例卵巢良性肿瘤组织（子宫内膜样腺瘤7例、浆液性囊腺瘤17例、透明细胞瘤1例、黏液性囊腺瘤10例），患者年龄19～86岁、中位发病年龄50岁，60例卵巢上皮性癌组织（子宫内膜样腺癌8例、浆液性囊腺癌40例、透明细胞癌2例、黏液性囊腺癌10例），患者年龄20～85岁、中位发病年龄49岁；纳入标准：病理结果证实为原发性卵巢良性肿瘤组织或卵巢上皮性癌，知情同意；排除标准：病理结果证实为原发于其他部位转移至卵巢的上皮性癌，未签署知情同意。卵巢上皮性癌采用FIGO分期标准施行相应具体分期，其中Ⅰ期卵巢上皮性癌为17例，Ⅱ期卵巢上皮性癌为14例，Ⅲ期卵巢上皮性癌为17例，Ⅳ期卵巢上皮性癌为12例；低分化卵巢上皮性癌为24例、中分化卵巢上皮性癌为23例，高分化卵巢上皮性癌为13例；所有卵巢癌病例术前均未行靶向治疗、免疫治疗、化学药物治疗以及放射治疗，各组间一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；兔抗人PDCD4多克隆抗体和兔抗人Clusterin多克隆抗体购自santa cruz公司，即用型免疫组化试剂盒购自中国北京中杉金桥公司。

1.2 免疫组化检测方法

将厚度为4μm的石蜡包埋组织切片，常规脱蜡至水化程度，切片浸泡于50mmol/L乙二胺四乙酸溶液（pH8.0）中，微波抗原修复10min，冷却至室温，之后充分水冲洗，然后用PBS浸泡洗，滴入正常山羊血清封闭液中，室温保存20min；丢弃多余的液体，不予任何洗涤，加入PDCD4多克隆抗体或者Clusterin多克隆抗体4℃过夜，PBS洗涤；在37℃条件下，滴加予SP 9000通用生物素标记二抗40min；给二氨基联苯氨30s显色，予以苏木精重新染色，乙醇脱水、透明，中性树胶封固。制备二氨基联苯胺显色液的规定步骤：将DAB 5mg溶于100mL 0.05mol/L的Tris-盐酸（pH7.6）中，加入10μL 30%过氧化氢，搅拌均匀后过滤（使用前予新配制）；以上述公司提供的常规阳性切片作为阳性对照品，PBS代替一抗作为阴性对照品。

1.3 阳性结果判定

PDCD4以及Clusterin以细胞质或者细胞核内出现有棕黄或者棕色颗粒为阳性细胞。采用半定量积分法测定表达结果，染色强度以及阳性细胞的比例分别登注为0～3分。染色强度：未着色0分，浅着色1分，中度着色2分，深着色3分。阳性细胞的百分率：在高倍镜下随机选择10个清晰视野（×400），每个视野计数100个细胞，计算平均阳性百分率。根据平均阳性细胞百分率分为：阳性细胞数≤5%登注为0分，6%～25%登注为1分，26%～49%登注为2分，≥50%登注为3分。两项评分相加，0～1分登注为（-），2分登注为（+），3～4分登注为（++），5～6分登注为（+++），（+）～（+++）均示为阳性[12]。

1.4 统计学分析

采用SPSS20.0软件对相关数据进行统计分析，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDCD4和Clusterin在卵巢上皮性癌组织以及卵巢良性肿瘤组织中的表达情况

PDCD4在卵巢上皮性癌组织中的阳性表达率为40.00%（24/60），明显低于卵巢良性肿瘤组织中的阳性表达率82.86%（29/35），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；Clusterin在卵巢上皮性癌组织中的阳性表达率为71.67%（43/60），明显高于卵巢良性肿瘤组织中的阳性表达率14.29%（5/35），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 PDCD4和Clusterin在卵巢上皮性癌组织和卵巢良性肿瘤组织的表达情况[n（%）]

表2 PDCD4表达水平与卵巢上皮性癌临床病理特征之间的关系

表3 Clusterin表达水平与卵巢上皮性癌临床病理特征之间的关系

2.2 PDCD4在卵巢上皮性癌组织中的表达与临床病理特征之间的关系

结果表明PDCD4表达水平与卵巢上皮性癌淋巴结转移、FIGO分期以及组织学分化程度明显相关（P＜0.05）。见表2。

2.3 Clusterin在卵巢上皮性癌组织中的表达与临床病理特征之间的关系

结果表明Clusterin表达水平与卵巢上皮性癌组织学分化程度、以及FIGO分期明显相关（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

PDCD4是一种新的肿瘤抑制mRNA，PDCD4表达的调节机制十分复杂，研究表明PDCD4在细胞凋亡过程中的表达上调，PDCD4的表达受微小RNA、转化生长因子-β等多种因素的调控，PDCD4表达水平可以影响转录、翻译以及调节多种信号转导途径，可在转录和翻译水平上调节多个下游基因的表达，而且充当肿瘤抑制剂的角色[13]；甘梅富等[14]学者研究表明：结直肠癌组织中的PDCD4表达水平明显低于癌旁组织，且在癌组织中PDCD4表达水平与结直肠癌组织学分级、TNM分期以及淋巴结转移明显相关；本研究结果表明PDCD4在卵巢良性肿瘤组织以及卵巢上皮性癌组织中表达阳性率依次降低，差异有统计学意义，随卵巢上皮性癌的FIGO分期增高，卵巢上皮性癌组织中PDCD4表达阳性率亦降低；卵巢上皮性癌组织低分化者的PDCD4表达阳性率明显低于卵巢上皮性癌组织高分化者的PDCD4表达阳性率和卵巢上皮性癌组织中分化者的PDCD4表达阳性率；卵巢上皮性癌有淋巴结转移患者的PDCD4表达阳性率明显低于卵巢上皮性癌无淋巴结转移患者的PDCD4表达阳性率；提示PDCD4在卵巢上皮性癌组织中的表达水平与PDCD4淋巴结转移、组织学分化程度以及FIGO分期明显相关；作为肿瘤抑癌基因的PDCD4在卵巢上皮性癌的发生、发展中起着一定的作用。

Clusterin亦称为TRPM2（ testosterone repressed message 2）、SGP2 （sulfated glycoprotein）、是 一 种普遍存在于人体组织细胞中的异源二聚体硫酸化糖蛋白，其功能主要有介导细胞聚集、稳定细胞膜、参与脂质交换和转运、辅助生殖、抑制补体介导的细胞免疫等，近期研究发现Clusterin在调节细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤、细胞粘附、组织重塑中起重要作用[15]；Almaghrabi等[16]学者研究发现Clusterin在子宫内膜样腺癌组织中总阳性率高于正常组织中的阳性率，Clusterin的阳性率与分化程度相关，分化程度越高阳性率越高，不同的临床分期中Clusterin的阳性率亦不相同；本研究结果表明随着在卵巢良性肿瘤组织、卵巢上皮性癌组织中Clusterin的表达阳性率依次升高，差异有统计学意义，随卵巢上皮性癌FIGO分期增高，卵巢上皮性癌组织中Clusterin表达阳性率亦升高；卵巢上皮性癌组织低分化者Clusterin表达阳性率明显高于高分化者和中分化者；提示Clusterin在卵巢上皮性癌组织中的表达水平与Clusterin组织学分化程度和FIGO分期明显相关；上述结果表明卵巢上皮性癌组织中PDCD4呈低表达和Clusterin呈高表达，检测PDCD4及Clusterin的表达情况对判断卵巢上皮性癌的生物学行为有一定的临床价值。