大豆多糖颗粒剂的制备及对草酸钙晶体生长调控的研究＊

肖治均，张特，潘婷婷



大豆多糖颗粒剂的制备及对草酸钙晶体生长调控的研究＊

肖治均，张特，潘婷婷

（商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000）

以大豆为原料提取大豆多糖（SPS），并以此为主要成分制备大豆多糖颗粒茶，拟开发出能够用于防治泌尿系结石新制剂。通过多糖含量测定试验、溶化性试验、粒度试验、水分测定试验对大豆多糖颗粒剂进行质量评价。体外考察了多糖颗粒剂抑制草酸钙结晶活性，着重考察了影响草酸钙成核、生长和聚集过程中的关键指标，即最大诱导时间、成核抑制率和聚集抑制率。结果表明，和对照组相比，成核速率在0.466×10-3/min左右、聚集速率在0.108×10-3/min左右，最大诱导时间在15.33 min左右，成核速率和聚集速率均下降，且最大诱导时间增加，成核抑制率和聚集抑制率分别达到77.78%和72.91%，抑制效果明显。

大豆多糖；大豆多糖颗粒茶；生长调控；紫外分光光度法

1 引言

泌尿系统结石是世界范围内的常见病，且其发病率呈上升趋势。欧美国家5～10年内该病的复发率为40%～50%，在中国则高于75%.草酸钙（CaOxa）是尿结石中主要的结石晶体，约占70%.而存在于尿液中的某些有机大分子，会在尿结石的形成过程中起到抑制或促进作用。这些大分子不仅与尿结石形成与否密切相关，而且在结石盐成核、生长、聚集和固相转化过程中发挥着至关重要的作用[1-3]。

生物大分子酸性粘多糖（GAGs）是目前研究较多的一类CaOxa结石抑制物。利用从天然产物中提取的多糖来抑制尿结石形成的研究日趋深入，张朝燕等对富含硫酸基的草叶马尾藻多糖的防石活性进行了研究，结果表明SGP对草酸钙的成核、聚集抑制率分别为69.2%、76.8%；王淼等人的研究也表明降解海藻多糖不仅可以抑制晶体的生长和聚集，而且可以诱导与尿路细胞粘附力较弱的晶体生物形成，从而减少草酸钙晶体的生成。

大豆多糖（SPS）是从大豆中提取精制的水溶性多糖，具有抗氧化、抑菌、调节免疫活性等生物学功能。分子结构类似球状体，黏性较低，具有分散性、稳定性、乳化性和黏着性等特点，其分子结构与尿液中存在的尿石盐抑制剂葡氨聚糖（GAGs）较为相似，可以清除羟基自由基，这使得SPS极有可能成为一种潜在的外源性绿色防石药物。

本文将大豆作为原料提取大豆多糖（SPS），并以此为主要成分制备大豆多糖颗粒，拟开发出能够用于防治泌尿系结石新制剂[4-9]。鉴于体内对泌尿系统结石的研究较为困难，该类研究目前都是在体外进行模拟研究，以此揭示尿石形成机理。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验试剂

大豆（陕西田源农业发展有限公司），草酸钠（天津市河东区红岩试剂厂），无水乙酸钠，无水氯化钙，氯化钠，苯酚，硫酸，三氯乙酸，蔗糖，糊精（天津市科密欧化学试剂有限公司），乙醚（天津市化学试剂有限公司），丙酮，无水乙醇，95%乙醇（利安隆博华医药化学有限公司），三氯甲烷（利安隆博华医药化学有限公司），正丁醇（天津市化学试剂六厂）。

2.1.2 实验仪器

电热恒温水浴锅HH-S6（北京科伟永兴仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱DHG-9123A（上海齐欣科学仪器有限公司），电子分析天平SI-2002（上海齐欣科学仪器厂），紫外-可见分光光度计UV-1780（岛津（中国）有限公司），离心机TD5A（湖南凯达科学仪器有限公司），冰箱BCD-228UTMA（合肥美的荣事达电冰箱有限公司），超纯水机ULUPUPE-H（四川优普超纯科技有限公司），高速中药粉碎机XFB-200（吉首市忠诚制药机械厂），循环水真空泵SHZ-III（巩义市予华仪器责任有限公司），旋转蒸发仪RE-52（北京科伟永兴仪器有限公司），药典筛GB/T6003.1—1997（新乡市同心机械责任有限公司），超声波清洗机KQ5200E（昆山市超声仪器有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 多糖标准曲线的绘制

2.2.1.1 对照品溶液的制备

取适量葡萄糖对照品于105 ℃干燥至恒重，从中精密称取50 mg置于500 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解定容，配制质量浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

2.2.1.2 标准曲线的制备

分别精密量取葡萄糖对照品溶液0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL于10 mL容量瓶中，蒸馏水定容至10 mL。从中量取1.0 mL的溶液，加入质量分数为6%的苯酚溶液1 mL混匀，迅速加入5 mL浓硫酸，静置10 min，摇匀，于30 ℃水浴中放置30 min，以0.0 mL为空白对照，于490 nm处测定不同浓度下的吸光度，并以对照品溶液浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程=9.414+0.040 8，2=0.990 4表明葡萄糖的质量浓度在0～0.1 mg/mL之间与吸收度的线性关系良好。

2.2.2 大豆多糖颗粒的制备

将大豆多糖、蔗糖、糊精研磨过100目筛，再按多糖∶蔗糖∶糊精=1∶9∶10的比例称取并混合均匀，将质量分数为70%的乙醇作为稀释剂制软材，20目筛挤压制粒，于55 ℃鼓风干燥60 min，10目、50目筛整粒[10]即得大豆多糖颗粒。

2.2.3 大豆多糖颗粒茶质量检查

颗粒剂主要质量指标的测定方法[11]如下。

2.2.3.1 多糖颗粒剂的含量测定

精确称取大豆多糖颗粒200 mg溶于20 mL蒸馏水中过滤。从中精密量取1 mL于10 mL离心管中，加入5 mL无水乙醇，摇匀，静置5 min，以4 000 r/min离心10 min，倾去上清，沉淀用蒸馏水溶解并定容至100 mL容量瓶中，作为供试样品。精确吸取1mL供试样品，按照标准曲线计算大豆多糖颗粒剂中多糖的含量。

2.2.3.2 溶化性试验

称取制备的大豆多糖颗粒5 g，加热水100 mL，搅拌5 min观察颗粒溶解情况。

2.2.3.3 粒度试验

称取制备的大豆多糖颗粒10 g，置于药筛内过筛，左右往返边筛动边轻叩3 min，其中不能通过10目筛和能通过50目筛的颗粒总量不超过总颗粒质量的15%.

2.2.3.4 水分测定试验

称取制备的大豆多糖颗粒2 g，置于干燥且恒重的称量瓶中，精密称定后，打开瓶盖在105 ℃干燥5 h，盖好瓶盖，移至干燥器中冷却30 min，再次精密称定。重复上述操作直到连续两次称重的差异不超过5 mg为止，计算含水量。根据制剂质量标准，供试品中含水量不得超过6%.

2.2.4 SPS抑制草酸钙晶体生长的活性检测

用紫外分光光度法测出晶体成核、聚集的参数[9，12]。

2.2.4.1 测出晶体成核参数

临用配置含1.0 mmol/L草酸钠、200 mmol/L氯化钠、10 mml/L醋酸钠的混合溶液以及8.0 mmol/L的氯化钙溶液。加入氯化钠和醋酸钠是为了将pH值调至5.7，此值最接近结石患者清晨尿液中的值。实验中所有的操作均在37℃的恒温水浴箱中进行，以此来模拟人类体温。

先将1.0 mL氯化钙溶液移至比色皿中并置于分光光度计中，然后加入1.0 mL含草酸钠的混合溶液，此时得到的混合溶液为含有4 mmol/L钙离子和0.5 mmol/L草酸根离子的亚稳溶液。当加入氯化钙溶液后，在620 nm条件下每20 s分光光度计记录一次，计录30 min，此为空白组实验。

2.2.4.2 测出晶体聚集参数

临用现配含1.5 mmol/L的草酸钠，300 mmol/L的氯化钠和15 mmol/L的醋酸钠的混合溶液，以及12 mmol/L的氯化钙溶液。以大豆多糖颗粒配置含SPS为0.01 g/100 mL的溶液作为抑制物。实验时所有的操作均在37 ℃的恒温水浴箱中进行。

先将1.0 mL氯化钙溶液转移到比色皿中并置于分光光度计中，再加入含草酸钠的混合溶液和抑制物溶液各1.0 mL，以获得4 mmol/L钙离子和0.5 mmol/L草酸根离子的亚稳溶液。当加入氯化钙溶液后，分光光度计每30 s记录一次，记录时间相应延长至60 min左右。分光光度计使用前调至620 nm，并预热20 min，平行测定3次。

3 结果与分析

3.1 大豆多糖颗粒剂的质量检测

3.1.1 多糖含量测定

大豆多糖颗粒剂中多糖的含量为4.43%.

3.1.2 溶化性试验结果

实验中，制备的大豆多糖颗粒随着搅拌，逐渐崩解。溶解时间1 min左右，最终得到澄清透明的淡白色溶液。

3.1.3 粒度试验结果

实验中不能通过1号筛（10目）和能通过3号筛（50目）的颗粒总质量为0.963 g，占总颗粒重的6.42 %，符合制剂相关要求。

3.1.4 水分测定试验结果

两次干燥称重的差值为0.084 g，含水量为4.2%，符合制剂相关要求。

3.2 SPS颗粒剂抑制草酸钙晶体生长的活性检测

本实验通过测定CaOx在620 nm处的吸光度值变化进行SPS颗粒剂抑制草酸钙晶体生长的活性检测。空白组的OD值变化曲线如图1所示，由图1可知，OD值变化趋势为先升高后降低。其中在OD值上升阶段：上升的OD值变化曲线斜率即为成核曲线速率，简写为N；达到最大值时所需的时间称为最大诱导时间，即max.在OD值下降阶段：下降的OD值变化曲线斜率即为聚集曲线速率，简写为A，而OD值下降的原因为由于晶体聚集从而导致微粒数减少，最终体现在OD值变化上。本实验通过比较max、N和A参数值，以此评价SPS的抑制CaOx成核、聚集能力。

从图1可看到，在没有添加抑制物时，随时间的延长大量晶体形成，吸光度逐渐达到最大值，之后因CaOx晶体的聚集OD值而逐渐下降。通过计算得max为8.67 min，N为2.1×10-3min-1，聚集速率A为0.4×10-3min-1。大豆多糖颗粒剂对草酸钙晶体生长影响活性检测如图2所示。SPS颗粒剂抑制草酸钙晶体生长的活性检测如表1所示。

图1 草酸钙晶体生长活性检测

注：（a）（b）（c）为三组平行实验结果

由图2和表1可知，与对照组相比，成核速率由原来的2.1×10-3min-1降低到0.466×10-3min-1左右，聚集速率由原来的0.4×10-3min-1降低到0.108×10-3min-1左右，最大成核时间由8.67 min延长至15.33 min左右，且成核抑制率和聚集抑制率分别达到77.78%和72.91%.因此，大豆多糖颗粒溶液对草酸钙晶体的成核、聚集能力具有良好的抑制效果。

表1 SPS颗粒剂抑制草酸钙晶体生长的活性检测

实验号评价指标 成核速率SN聚集速率SA/min-1最大成核时间tmax/min成核抑制率/（%）聚集抑制率/（%） 10.5×10-30.105×10-314.3176.273.75 20.46×10-30.12×10-315.578.170 30.44×10-30.1 ×10-316.279.0575 均值0.466×10-30.108 ×10-315.3377.7872.91

注：成核抑制率=[1－（NM/NC）]×100%；聚集抑制率=[1－（AM/AC）]×100%

4 结论与讨论

4.1 结论

以大豆多糖为主要原料制备的大豆多糖颗粒，其剂型符合颗粒剂相关质量要求，多糖含量为4.43%.进一步考察了大豆多糖颗粒茶对草酸钙晶体生长活性的影响，结果表明：加入大豆多糖颗粒茶后，N由2.1×10-3min-1降到0.466×10-3min-1左右、A由0.4×10-3min-1降到0.108×10-3min-1，max由8.67 min延长至15.33 min，且成核抑制率和聚集抑制率分别达到77.78%和72.91%.由此可见，所制备的大豆多糖颗粒溶液对草酸钙晶体的成核、聚集能力有良好的抑制效果。

4.2 讨论

CaOx结石的病因与发病机制复杂，在控制CaOx的发生率和复发率方面，还有很多研究工作要做。本课题研究的目的是探索大豆多糖存在下制备的颗粒剂对草酸钙结石形成的影响，从而为人类防治结石提供新的思路。而由于人体的内部环境是一个复杂的体系，制剂的主要成分在体内的转化过程使得制剂的作用发生很大的改变，因此，利用注射、灌胃口服等技术手段，设计合理的动物实验，选择科学的分析统计方法，将有利于研究大豆多糖颗粒剂在体内环境对草酸钙结石的影响，从而为结石类新药筛选提供有利的保证。

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潘婷婷（1988—），女，山西临汾人，助教，硕士学位，主要研究方向为中药资源开发。

国家级大学生创新创业训练计划项目（编号：201611396007）

2095－6835（2019）02－0024－03

TS201.2

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.02.024

〔编辑：严丽琴〕