野核桃青皮中胡桃醌含量测定及抗菌活性研究

2019-02-13杨霞赵玉雪朱佳敏吴柳燕黄安香

应用化工 2019年1期

杨霞，赵玉雪，朱佳敏，吴柳燕，黄安香

(1.贵州省核桃研究所，贵州贵阳 550005；2.贵州省林业科学研究院，贵州贵阳 550005)

野核桃是胡桃科胡桃属的落叶乔木，主要分布在我国的西北、西南等多个省份，在贵州很多地方都有分布，主要集中在六盘水、黔东南、遵义和铜仁等地区[1-2]。野核桃的果实坚硬，不易取仁，适宜在工艺品方面进行开发利用，而其木材较为优良，材用价值较高。目前对于野核桃的研究包括：资源现状分析[3-4]、种群统计、果的表型及生长特性方面[5-8]，在化学成分方面，对野核桃根皮、叶片的主要化学成分及野核桃壳中的元素进行了测定[9-11]，但是关于野核桃青皮化学成分及抗菌活性的研究仍然未见报道。

本研究拟通过高效液相色谱对贵州野核桃青皮中胡桃醌含量进行测定，并测定胡桃醌对5种植物病原菌的抗菌活性，为野核桃资源的分析和利用提供一定理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

胡桃醌标准品(纯度大于99%)；甲醇，色谱纯；超纯水(娃哈哈公司)；醋酸，分析纯；野核桃青皮，采自贵州省盘州市松河乡；云南泡核桃青皮，采自贵州省正安县瑞溪镇；本地泡核桃青皮，采自贵州省息烽县西山镇(核桃青皮样品经70 ℃烘干后粉碎成粉末备用)；供试菌株有含笑枝枯病(Botryosphaeriadothidea)、西康玉兰根腐(Fusariumoxysporum)、马尾松溃疡病(Sphaeropsissapinea)、核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)、山茶立枯病(Rhizoctoniasolani)由贵州省林科院森保所分离鉴定。

Agilent 1220 高效液相色谱系统(紫外检测器、二元泵溶剂系统、自动进样器、柱温箱、Chemstation工作站)；色谱柱Geminu 5U C18110 A (250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 色谱条件[12]

设置紫外检测器(HPLC-VWD)的最大吸收波长为250 nm，使用Geminu 5U C18110A (250 mm×4.6 mm，5 μm)反相色谱柱，色谱柱温度30 ℃。缓冲液为甲醇(A)∶1%醋酸水溶液(B)=55∶45(体积比)，缓冲液流速0.8 mL/min，总进样时间20 min，样品进样量为10 μL。

1.3 标准曲线绘制

1.3.2 标准曲线绘制用200 μg/mL的标准母液配制成 3，5，8，10，15，50 μg/mL的标准液，按照1.2节所述方法进行检测。每个浓度3次重复。以浓度为横坐标，峰面积平均值为纵坐标绘制标准曲线，见图1。

图1 胡桃醌标准曲线Fig.1 The standard curve of juglone

1.4 样品提取

称取干燥的野核桃青皮粉末4 g于三角烧瓶中，加入60 mL无水乙醇，在35 ℃、100 W条件下超声1 h，抽滤，滤液转移至梨形瓶中旋蒸，然后加入200 mL甲醇，进行溶解，取2 mL过0.45 μm的滤膜于试剂瓶中，待HPLC检测。

1.5 胡桃醌对不同植物病原菌抑制效果初筛

对5种病菌：含笑枝枯病(Botryosphaeriadothidea)、西康玉兰根腐病(Fusariumoxysporum)、马尾松溃疡病(Sphaeropsissapinea)、核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)、山茶立枯病(Rhizoctoniasolani)进行初步抑菌活性测定，用甲醇将胡桃醌配制成浓度为200 mg/L的药液，采用平板生长法[11]测定胡桃醌的抑菌活性。每个病菌设置3个重复，并设置溶剂对照，计算抑制率。

抑制率=

1.6 胡桃醌对两种植物病原菌的毒力测定

初筛后胡桃醌抑制效果较好的病菌为马尾松溃疡(Sphaeropsissapinea)和核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)，对这两种病菌分别进行EC50值的测定：设计5个质量浓度梯度200，160，120，80，40 mg/L，采用1.5节的方法测定各个处理下菌丝的增长情况，并且计算抑制率。对所得数据进行回归分析，得回归方程y=ax+b及线性相关系数r，分别计算胡桃醌对病原菌的EC50值。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

在流动相缓冲液为甲醇(A)∶1%醋酸水溶液(B)=55∶45(体积比)，色谱柱温度30 ℃，流速为0.8 mL/min时，能够较好分离样品的目标峰和杂质峰，样品出峰时间为12.66 min。得到的色谱图见图2。

图2 胡桃醌标准品(A)及野核桃青皮样品(B)的HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of juglone andJugians cathayensis Dode sample

2.2 提取条件优化

2.2.1 提取方式分别以冷浸24 h、回流1 h、超声30 min的方式进行胡桃醌提取。回流法、超声法和冷浸法的收率见图3a。

由图3a可知，以加热回流提取1 h，平均收率为82.80%；超声30 min，平均收率为81.94%；冷浸24 h，平均收率为49.5%。加热回流法的收率略大于超声法的收率，但考虑加热回流耗时较长，操作复杂，杂质干扰较大，且温度过高会导致胡桃醌降解等因素，采用超声法进行提取较为适宜。

对于一些常无ASF疫病暴发的国家与区域，还需要做好生猪以及相关产品的管理工作。ASF作为一种扩散性疾病，一旦爆发还会造成非常严重的经济损失，对于该区域的养殖效益与经济效益还会产生巨大的威胁，这也就要求各国家能做好ASF的预防工作，促进自身的养殖行业得到进一步的发展。各级政府部门需要加强对诊断试剂以及疫苗生产的研究与储备工作，不得从有疫病的国家中进行生猪、猪饲料以及猪肉相关产品的进口工作，并需要在海关等单位做好生物安全防护措施[2]。

2.2.2 提取液料比按照料液比1∶8，1∶15，1∶20 g/mL(青皮质量∶乙醇)超声提取30 min，结果见图3b。

由图3b可知，料液比增加时，平均收率先升后降，料液比1∶15 g/mL时收率最高，且乙醇的用量也较为合理。

2.2.3 提取时间由图3c可知，提取时间1 h时，收率最高。

2.2.4 提取温度由图3d可知，随温度升高，胡桃醌的收率先升后降，温度35 ℃时，胡桃醌的收率最高，可能温度过高导致胡桃醌降解。因此，35 ℃为最佳提取温度。

图3 胡桃醌提取条件优化Fig.3 Optimized the extracting conditions of juglone

2.3 回收率稳定性验证

分别在野核桃青皮样品中加入胡桃醌标样5，10，15 μg，按照1.4节的方法进行处理，每个浓度做5个平行，测定其回收率，结果见表1。

表1 三个添加水平的野核桃青皮中胡桃醌的回收率(n=5)Table 1 Recovery rates and RSD values of juglone inJugians cathayensis Dode at three spiked levels

注：①4 g中野核桃青皮胡桃醌的含量；②回收率的平均值。

由表1可知，添加回收率的范围为70%～120%，RSD<10%。因此，该方法的稳定性和准确性较好。

2.4 样品分析

分别测定了盘州市野核桃青皮、正安县云南泡核桃青皮和息烽县本地泡核桃青皮中胡桃醌的含量，结果见表2。

表2 不同品种核桃青皮中胡桃醌含量(n=3)Table 2 The content of juglone in the peel ofdifferent walnut varieties

由表2可知，本地野核桃青皮中胡桃醌含量最高，为0.84 mg/g，本地泡核桃青皮胡桃醌含量为0.53 mg/g，云南泡核桃青皮中胡桃醌含量为 0.41 mg/g。

2.5 胡桃醌对不同植物病原菌抑制效果初筛

200 mg/L的胡桃醌溶液对含笑枝枯病(Botryosphaeriadothidea)、西康玉兰根腐(Fusariumoxysporum)、马尾松溃疡病(Sphaeropsissapinea)、核桃枝枯病(PhomopsisvacciniiShear)、山茶立枯病(Rhizoctoniasolani)的抑制率分别为：29.24%，46.57%，83.39%，66.79%，27.44%(见表3)。其中胡桃醌对马尾松溃疡病和核桃枝枯病的抑制效果较好。