猪场养殖废水灌溉对土壤微生物细菌群落多样性的影响

程智超，栾雨阳，康浩洋，王文浩，吴昊旻

（1.黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨 150000；2.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030；3.农业农村部甜菜品质监督检验测试中心，黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨 150000）

水是生命之源，20 世纪70 年代以来，人口迅速增加，城市化工业化发展日益加快，水资源短缺已经威胁到了粮食生产，随意排放养殖废水一方面增加水污染，另一方面损害周边居民的生活与健康，在这项研究中，我们调查了土壤细菌群落的组成与猪场养殖废水的关系。研究地点位于中国东北的三江平原，试验地种植水稻，用已处理的养殖废水与未处理的养殖废水和清水进行浇灌。细菌特异性16S rRNA 内部转录间隔区的高通量测序用于鉴定细菌分类群。在所有三种样品类型中，细菌多样性在已处理的未处理的养殖废水用中最高，在清水中较低，经过处理的养殖废水最低。这些发现强调了有效管理土壤细菌群落以维持自然功能土壤生态系统的重要性，提出适宜的养殖废水灌溉方法.。

养殖废水被我国充分发挥其“水肥效应”优势，深刻感受到养殖废水对我国的重要影响，取得了非常大的利益。但是，养殖废水规模的进一步扩大，环境也随之出现了问题，土壤由于钠害的退化;有毒元素对作物的毒害与污染等。由此可见，养殖废水灌溉对农作物生长、以及对农田环境的污染等方面都存在着诸多的不定因素。

基于高通量DNA 测序技术，在此评估土壤细菌群落的多样性，实验研究对揭示养殖废水灌溉土壤环境的影响有重要帮助。该研究有助于改善土壤生态系统，对农民保护和利用农田提供明确指导。

1 场地描述与土壤采样

该研究在黑龙江省科学院自然与生态研究所三江湿地实验站（北纬47°35'，东经133°31'）进行。当地月平均气温在1月为-21.6 ℃至7月为21.5 ℃，年平均气温为1.9 ℃。海拔55～65 m，年平均降水量为550～610 mm，其中约80%发生在5～10月。

根据试验地的土层厚度特征，利用用剖面取样法，于2018 年10 月15 日在0～20 cm 的深度采集土壤样本，每块地选取有代表性的5个点取土样。在每个地点取样约1 500 g 。把每份新鲜的土样用连个袋子装，一个袋子的新鲜土样用来自然风干，风干后，磨成粉，检查密封性后,装好放于4C冷却，立即送回实验室，并及时进行试验检测。

2 土壤微生物DNA的提取

利用FastDNA0 SpinKitforSoil试剂盒MPBiomedicals提取0.5 g 三组土壤细菌基因组总DNA，将每组提取得到的土壤DNA 溶解在70 μL 无菌TE 缓冲液40 mmol·L-1TrisHCl，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）详细按说明书进行操作。

高通量测序：细菌基因组总DNA 送到上海Majorbio 生物技术有限公司进行Miseq高通量测序。细菌16srDNA扩增引物采用通用引物（8F/533R）。

3 基因优化

可以正向或反向地影响到基因的表达，内含子供体和接入位点的共同识别序列分别是CAG，GUA。在前一个接入位点上的外显子下游也有一个富含GAG 的区域。外显子中剪接增强子的存在能极大地促进内含子的切除和成熟mRNA 向细胞质的外送。在载体设计中,在eDN&前至少加入1个内含子会促进cDNA 的表达。而为了切除内含子，则需要在第一个和最后一个外显子中包含剪接增强子序列有助于精确控制外源基因编码序列的高表达。

OTU 群落聚类及相关分析：按每个小组为一个OUT 的原则，通过归类操作，将序列按照DNA 相似性分为许多个小组。通常按97%（0.03）的有序列进行OTU 划分并进行生物信息统计分析。

构建稀疏曲线：利用已测得16S rDNA 序列中已知的各种OTU 的相对比例，来计算抽取n个（n小于测得reads 序列总数）reads时出现OTU数量的期望值。

PCoA 分析：通过一系列的特征值进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，利用PCoA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标，并且不改变样品点之间的相互位置关系，只改变了坐标系统。通过PCoA 分析可以用来观察每个个体与群落之间的关系。

4 小 结

从3 种灌溉用水对土壤微生物细菌群落的影响来看，对农田的耕种及利用方式具有重要作用。土壤微生物细菌多样性可以表示上壤生态系统的变化。用未处理养殖废水灌溉与用清水灌溉和已处理养殖废水灌溉相比较，用未处理养殖发水灌溉后，土壤微生物群落得到一定改善，土壤养分升高，改善了土壤微生物学性质。本研究意在通过灌溉养猪养殖废水种植农作物，测试土壤微生物细菌群落的组成，探讨该养殖废水用于农作物裁培的可能性,为养殖废水灌溉方法提供适宜的方法。