脓毒症患者血清微小RNA-21的水平变化及其意义

李伟超,张亭,潘尉,杨建海

(中国人民解放军联勤保障部队第983医院,天津300142)

脓毒症主要是指由感染因素引发的一种全身炎症反应综合征，是临床上严重创伤、感染、休克患者最为常见的并发症之一，如不给予及时有效治疗，随着病情不断进展会引发脓毒症休克以及多器官功能障碍综合征，是导致重症监护病房患者死亡的最主要原因之一[1]。尽管目前我们对脓毒症的发病机制有了一定的认识，但其病死率仍未得到有效控制[2]。因此，寻找一种可早期诊断脓毒症的生物标记物显得尤为重要。微小RNA(miRNAs)主要是通过调节基因的表达，从而有效调节细胞新陈代谢以及分化、增殖、凋亡等过程，进一步在机体生理病理过程中发挥至关重要的作用[3]。有研究报道显示，miRNAs在脓毒症患者中存在异常表达，其可能成为脓毒症患者早期诊断以及预后评估有效指标[4]。miRNA-21是微小RNA的一个重要亚型，其与机体的炎症反应具有一定关联性。目前，临床上关于miRNA-21与脓毒症关系的报道较少。本研究观察了脓毒症患者血清miRNA-21水平的变化，并探讨了其与病情、预后的关系，同时评估了其诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月～2018年6月中国人民解放军联勤保障部队第983医院收治的脓毒症患者83例(脓毒症组)，男52例、女31例，年龄24～71(48.35±10.42)岁。纳入标准[5]:与拯救脓毒症战役(SSC)关于脓毒症最新诊断标准相符；住院时间≥5 d；临床病历资料完整。排除标准:合并心、肝、肾等脏器功能严重障碍者；伴有脑梗死或急性冠脉综合征者；伴有肿瘤疾病或免疫系统疾病者。

根据患者病情严重程度:一般脓毒症[5]50例(无休克组)、休克性脓毒症(由脓毒症导致的低血压经液体复苏后收缩压仍<90 mmHg，需予以升压药物维持者)33例(休克组)。另取同期于本院进行体检的健康者50例作为对照组，其中男32例、女18例，年龄23～73(49.01±10.28)岁。脓毒症组与对照组性别、年龄有可比性。

1.2 临床病情严重程度的评估 入院24 h内采用急性生理功能和慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分及有无休克评估患者的病情严重程度。

1.3 血清miRNA-21检测 脓毒症组分别于入院第1、3、5天，对照组于入院体检时采集外周静脉血5 mL，以3 000 r/min离心10 min，取上层血清保存于-80 ℃冰箱中待检。根据mir Vana PARIS试剂盒说明书提取血清总RNA，并在稀释后参照逆转录试剂盒说明书完成逆转录反应，其反应体系包括RTace 0.5 μL，RT 5×Buffer 4 μL，RNase抑制剂0.5 μL，稀释后的RNA 12 μL，逆转录引物RT prime 1 μL，dNTP 2 μL。逆转录后获得cDNA进行稀释，采用qRT-PCR技术测定miRNA-21。miRNA-21上游引物序列:5’-CGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3’；下游引物序列:5’-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3’；以U6为内参，上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物:5′-AACGCT-TCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应体系:cDNA 1 μL，DEPC水3 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，SYBR 5 μL。95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃ 30 s，40个循环进行PCR扩增，用2-ΔΔCt表示血清miRNA-21的相对表达量。

1.4 血清miRNA-21的水平与脓毒症患者预后关系分析 对所有脓毒症患者进行随访，随访截止日2018年7月26日或患者死亡。记录患者生存情况。按照28 d病死率分为存活组67例与死亡组16例，比较两组血清miRNA-21水平，以评估血清miRNA-21水平与预后的关系。

2 结果

2.1 两组不同时间点血清miRNA-21水平比较 脓毒症组入院第1、3、5天血清miRNA-21水平分别为(1.97±0.90)、(1.02±0.71)、(0.53±0.31)ng/μL，对照组为(0.48±0.33)ng/μL。各指标组间(F=106.438)、时间(F=80.932)及交互作用(F=80.932)均有统计学意义(P均<0.05)。与入院第1天比较，脓毒症组入院第3、5天miRNA-21水平均低(P均<0.05)。入院第1、3天脓毒症组血清miRNA-21水平均高于对照组(P均<0.05)。

2.2 休克组与无休克组血清miRNA-21、APACHEⅡ评分比较 入院第1天休克组、无休克组血清miRNA-21水平分别为(2.66±0.48)、(1.27±0.28)ng/μL，APACHEⅡ评分分别为(31.95±4.87)、(16.32±2.59)分。休克组血清miRNA-21水平及APACHEⅡ评分均高于无休克组(t分别为15.106、16.917，P均<0.05)。

2.3 血清miRNA-21检测对脓毒症的诊断价值 入院第1天血清miRNA-21诊断脓毒症的敏感度为73.47%，特异度为38.29%，ROC下面积为0.752(95%CI=0.501～1.003，P=0.008)，第3天血清miRNA-21诊断脓毒症的敏感度为62.94%，特异度为35.71%，ROC下面积为0.722(95%CI=0.452～0.992，P=0.015)。

2.4 血清miRNA-21水平与脓毒症患者生存情况的关系 存活组入院第1、3、5天血清miRNA-21水平分别为(1.65±0.49)、(0.78±0.15)、(0.48±0.13)ng/μL，死亡组分别为(3.03±0.78)、(1.53±0.32)、(1.02±0.09)ng/μL。各指标组间(F=404.437)、时间(F=586.825)及交互作用(F=40.688)比较,P均<0.05。入院第1、3、5天，存活组血清miRNA-21水平均低于死亡组(P均<0.05)。

3 讨论

脓毒症属于严重创伤、感染以及休克最为常见的并发症之一[6]。在脓毒症的发展过程中，特征性补体系统的激活以及先天免疫系统的过度活化等因素会影响巨噬细胞与中性粒细胞对细胞因子、趋化因子等炎性介质的反应，从而分泌更多的氧自由基等刺激炎症介质，进一步加剧了炎症反应，促使机体调控机制失调，继而对组织器官造成损伤，最终导致机体脓毒症休克甚至死亡[7]。由此，尽早地对脓毒症进行诊断，评估脓毒症患者病情严重程度以及预后是早期有效控制脓毒症发展、降低脓毒症患者死亡率的重要途径。既往，临床上主要是通过临床症状、体征检查，血常规检查以及病原菌检查等方式诊断脓毒症[8，9]。然而，临床症状、体征检查以及病原菌检查受主观性的影响较大，可能导致诊断结果出现误差；血常规检测无法对脓毒症进行早期诊断，存在一定的局限性。随着相关研究的不断深入，越来越多的学者发现，miRNA-21在多种炎性状态下表达升高，且在血清中稳定存在，这为血清miRNA-21作为脓毒症的生物标记物提供了理论依据[10]。

miRNA-21属于miRNAs家族中的一个亚型，主要位于17q23.2染色体FRA17脆性区域上，存在高度保守性，在血清等体液中稳定存在，在多种炎性状态表达均显著升高，不但可自己调控促炎因子以及抑炎因子的表达，同时可通过对炎症信号传导通路的其他关键分子产生作用，从而可有效反映脓毒症患者的炎症状态[10]。本研究结果表明，入院第1、3天脓毒症组血清miRNA-21水平均高于对照组，休克组血清miRNA-21、APACHEⅡ评分均高于无休克组，提示脓毒症患者血清miRNA-21水平升高，随着脓毒症患者病情的逐渐加重，血清miRNA-21水平逐渐升高，其主要原因可能是因为脓毒症症状的加剧导致了患者机体中的炎症状态更加明显，进而诱发了血清miRNA-21水平上升，提示血清miRNA-21水平与脓毒症患者的病情有关。

本研究中，我们将入院第1、3天的血清miRNA-21检测进行ROC分析，结果显示第1、3天血清miRNA-21诊断脓毒症的ROC下面积为0.752及0.722，敏感度分别为73.47%、62.94%，，特异度分别为38.29%、35.71%，与刘姿等[11]研究报道相符，提示其可作为临床脓毒症的早期诊断指标之一，但其特异度并不是很高。有研究[12，13]报道，血清miRNA-21在多种肿瘤以及心血管疾病患者中均存在不同程度的异常表达。因此认为，miRNA-21可能并非是脓毒症的特有指标，临床工作中可通过联合其他标志物(如PCT)以及相关临床资料进行综合检测，从而提高脓毒症早期诊断的准确性。

本研究还发现，入院第1、3、5天存活组患者血清miRNA-21水平均低于死亡组，提示血清miRNA-21可能与脓毒症患者的预后也有关系，其原因主要是miRNA-21的表达升高可能对机体全身性炎症反应的爆发产生一定程度的影响，从而导致血清中白细胞介素-6、白细胞介素-8以及肿瘤坏死因子-α等一系列炎症因子过量释放，进一步导致患者病情逐渐恶化，甚至死亡。

综上所述，脓毒症患者血清miRNA-21水平升高，其水平变化可反映患者病情严重程度，有助于脓毒症的早期诊断，且有利于预后的评估。需要指出的是，本研究也有一定的不足之处，比如研究样本量比较少，且随访时间也相对较短，今后可通过扩大样本量、并延长随访时间的方式获得更加准确的研究结果。