基因疫苗在畜禽传染病中的作用

楚遵锋 （山东省动物疫病预防与控制中心 山东 济南 250022）

基因疫苗亦称DNA疫苗，是将编码某种蛋白质抗原的真核重组表达载体直接注射机体，在宿主细胞中表达外源基因，诱导特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答，达到预防和治疗疾病的目的。基因疫苗在病毒感染性疾病中有广阔的应用前景，已成为疫苗研究领域的热点之一。基因疫苗被称为第三次疫苗革命。基因免疫已在畜禽传染病，如病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫免疫、抗肿瘤免疫、预防变态反应中发挥了巨大的作用。

1 基因疫苗的作用机制

当基因疫苗注射入机体后，肌肉细胞通过特有的T小管管状系统和细胞膜穴样内陷将外源基因纳入，在该基因携带的强启动子作用下表达相应蛋白。表达产物在细胞内被降解成为8～10个氨基酸短肽，这些短肽含有不同的表位，分别与MHC-I类分子和MHC-II类分子结合，递呈到细胞表面，与MHC-I类分子结合的短肽激活CD8+T细胞(CTL)，与MHC-II类分子结合的短肽则激活CD4+T细胞(TH细胞和炎性T细胞)，而分泌到细胞外的抗原则被带有相应抗体的B细胞捕捉，并在TH细胞分泌的细胞因子作用下转化为浆细胞，大量产生抗体。对于传统的免疫方法，其免疫效应是由骨髓来源的“专职“抗原递呈细胞启动的，而在基因免疫中，肌肉接种的抗原表达则发生在骨骼肌细胞，皮肤接种的则依靠角质细胞。质粒DNA接种于靶位，一部分质粒DNA进入靶细胞表达抗原蛋白，另一部分质粒DNA可被转移到存在于该部位的淋巴细胞或巨噬细胞，还有部分游离存在，血液和淋巴组织将靶细胞表达的抗原蛋白、游离质粒DNA及质粒DNA转染的淋巴细胞输运到淋巴结和脾脏，在此部位被转移细胞表达的抗原由抗原递呈细胞递呈抗原，并产生效应T淋巴细胞和B淋巴细胞，同时形成生发中心，B细胞在生发中心成熟分化并定位于骨髓中，在骨髓中产生大量持续性抗体；在此过程中形成记忆性T细胞与生发中心抗原库相遇时骨髓中的B细胞又分泌抗体。这个过程循环进行而持续产生抗体，且在DNA疫苗表达抗原时，不同的接种方法、剂量会引起不同的T细胞反应。

2 基因疫苗的免疫方法

2.1 接种靶细胞的选择 基因疫苗接种靶细胞选择应考虑到细胞吸收和表达外源基因的能力；被转染细胞将表达抗原递呈给免疫系统能力；接种操作的简便性和安全性。骨骼肌细胞因其特有的T管状系统使其吸收和表达外源基因的能力是其他组织的100～1000倍，但目前最为有效的方法是将包被于金颗粒表面的裸DNA注射入表皮细胞，这可能与皮肤组织富含郎罕氏细胞有关。还发现皮肤组织细胞也能以某种方式吸收裸DNA分子，这就为通过皮下或皮内注射等常规途径进行基因疫苗接种提供了可能。

2.2 接种方法 使用基因枪将DNA包被的金颗粒注射入表皮；借助外科手术直接用基因枪接种；颗粒轰击法，利用高压放电作用将DNA包在微小包金颗粒上，把DNA转入各种细胞和器官。

2.3 注射途径与免疫效果 Fynan用50～300ug甲型流感病毒HA基因的纯DNA接种2次，然后以致死剂量的同一亚型流感病毒攻击，比较了不同注射途径和方式对免疫效果的影响。结果显示在小鼠，肌注、静注和黏膜免疫的保护率分别为67%～95%、83%、76%；在鸡3种接种途径的保护率分别为25%～63%、24%、30%。其研究结果表明了粘膜免疫和静注接种DNA苗也能诱发较强的免疫应答；不同途径接种效果的差别反映了体内细胞转染效率和转染细胞将抗原递呈给免疫系统的效率；转染效率并非决定免疫效果的唯一因素。

3 基因疫苗免疫的特点

3.1 更有效的免疫 基因疫苗不仅可以诱导针对保守抗原的保护性抗体产生，同时细胞内蛋白的表达提供了内源性多肽，激发了CTL介导的细胞免疫，这样就对病毒及胞内菌感染的防制就更加有效；而且，基因疫苗接种后，抗原在细胞内的表达与病毒自然感染过程一致，这对于以构象型抗原表位诱发中和抗体产生极为重要。而目前的重组技术在体外合成的蛋白抗原常造成构象型抗原表位的改变和缺失。

3.2 同种异株交叉保护 在制备基因疫苗时，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇，选择某一病原体的编码保守蛋白的核酸序列作为基因疫苗，因其不会变异，故可对同一种病原的漂变型或新型毒株产生交叉免疫，起到保护作用。

3.3 联合免疫 在同一载体的适当位置上，插入多种编码病原体保护性抗原的基因，接种后就可以产生针对多种病原体的联合免疫效果。

3.4 制备简便省时省力 基因疫苗的制备只需对编码抗原的基因进行设计和克隆，不需在体外表达和纯化蛋白，而且外源基因较容易克隆进表达载体，数天内可以扩增并纯化，这样特别有利于迅速研制新的疫苗用于对流行病暴发的控制。

3.5 免疫应答持久 Wolff报道在注射后19个月仍能检测到外源基因的相当数量的表达，肌注5个月用PCR方法仍然能够检测到外源质粒DNA存在。这样外源基因持续存在使得机体特异的记忆细胞被强化，从而使保护性免疫持久存在。

3.6 可重复使用，安全稳定 在目前的实验中，尚未检测出针对载体的抗体，因而同一载体可用于转运不同的靶基因而重复使用；也没有检测到外源基因在宿主染色体上的整合，从而避免了使用活毒疫苗免疫接种潜在的危险。

4 基因疫苗在畜禽疾病中的作用

4.1 病毒性疾病 在病毒性疾病中，已知由质粒DNA编码的可引起免疫应答的抗原有：流感病毒血凝素，基质蛋白及核蛋白，HIV-l gp120及gp160，牛疱疹病毒gIV，狂犬病毒，HBV表面抗原，HCV核心抗原，结核分枝杆菌Hsp65及Ag-85，肺炎支原体A7-1及A8-1抗原，艾滋病病毒，猪口蹄疫病毒，鸡新城疫病毒F蛋白，鸡传染性法氏囊病病毒多聚蛋白，传染性支气管炎病毒S1蛋白等，动物实验表明接种这些抗原对强毒的攻击都有不同程度的保护性，而且对某些抗原漂移毒株及不同亚型毒株的攻击具有交叉保护性。

4.2 细菌性疾病 结核分支杆菌Ag85A，B，C，Hsp65，AhpC蛋白，钩端螺旋体OSPA抗原，破伤风毒素抗原，肺炎支原体抗原，沙眼粒性结膜炎 MOMP CTP抗原，伤寒沙门氏菌Ompc蛋白，李斯特菌溶血素等抗原均能不同程度地诱导机体产生特异性地体液和细胞免疫应答。

4.3 寄生虫 DNA疫苗可用于预防单核和多核寄生虫，已发现的有反刍动物考德里立克次氏体主要抗原蛋白1，利什曼原虫主要表面糖蛋白gp63，克氏锥虫抗原CSP蛋白，疟原虫CSP，PySSP2蛋白。并且DNA疫苗诱导Th1的T辅助反应、CTL、INF-γ以及一氧化氮(NO)的释放具有杀伤寄生虫的能力。

4.4 抗肿瘤 用细胞因子和共刺激分子对肿瘤细胞进行遗传性修饰，可用作肿瘤疫苗，许多学者用各种细胞因子修饰人类多种恶性肿瘤(如肾癌，结肠癌，膀胱癌等)的瘤细胞。Gilboa等报道IL-2基因或INF-γ基因修饰的CMS-5肿瘤细胞，在合成基因鼠中失去瘤性，在MHC-II分子限制的CD4+T细胞的辅助下，有效的分泌IL-2，从而介导MHC-I类分子限制的CD8+T细胞前体活化并促其成熟，CD4＋和CD8＋T细胞相互作用而建立保护性免疫反应，能有效抑制CMS-5的肿瘤细胞。将编码肿瘤相关抗原的基因转导到肿瘤细胞内表达，可提高肿瘤的免疫原性，用于预防癌症。用编码有人癌胚抗原的质粒DNA免疫犬可预防乳房癌和结肠癌；DNA编码的鼠pg75相关蛋白1、原癌基因P53、人gp100等表达诱导的免疫反应可保护相应肿瘤细胞的攻击。另外编码有免疫球蛋白基因可用于治疗B细胞淋巴瘤。

4.5 抗过敏反应 肥大细胞和嗜碱性细胞表面的IgE与变应原结合，导致组织胺和炎症介质的释放而激发变态反应。编码变应原基因的质粒DNA为过敏反应提供了一种新的免疫治疗方案。肌注DNA疫苗诱导以IgG2α为主的抗体，能中和变应原；DNA疫苗诱导的Th1反应，能抑制抗原特异性IgE的合成和嗜酸性粒细胞的激活。体内实验表明，DNA疫苗可以下调抗原特异性IgE抗体而减少由迟发性变态反应带来的嗜酸性细胞的渗透、组织损伤和变态炎症等。

4.6 自身免疫反应性疾病 实验性过敏脑脊髓炎(EAE)是一种自身免疫反应性疾病，在鼠中这种疾病可被治病性T细胞表达T细胞受体(TcR)可变区Vβ8.2所激活，为此，编码有Vβ8.2TcR质粒DNA肌注小鼠可致病Th1反应向保护性Th2反应转化，从而达到治疗EAE的目的。

4.7 制备基因工程抗体 基因免疫为各种抗体的制备开辟了一条新途径，Barry等给小鼠接种3次hGH基因后，测到高水平的抗hGH多克隆抗体，用这种小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞建立杂交瘤细胞，成功地制备了单克隆抗体。

4.8 筛选抗原保护性基因 对于保护性抗原尚不明确，或表达抗原难以纯化的抗原蛋白(如疟原虫、棘球蚴)，则可选用病原不同的基因片段制备基因疫苗进行动物试验，有望能筛选到病原的宿主保护性的基因片段。

5 基因疫苗存在的问题

（1）一个关注点就是外源基因的随机整合而引起细胞的转化，导致原癌基因的插入性活化或抑制基因的插入性失活，这就需要高度敏感的PCR技术确证所注射的DNA不与宿主基因组发生整合，目前已得到的证据表明大部分由终分化细胞组成的肌细胞中，质粒载体没有插入宿主基因组中。可能的解决办法是提高DNA疫苗的有效性，包括其转染效率和APC的抗原递呈，从而减少感染细胞所需要的免疫剂量，这样就减少了整合机率。另外报道可以构建一种新的携带“自杀”基因的载体，在整合时会自发灭亡。（2）另外一个值得考虑的是潜在的抗DNA抗体的形成。大剂量注射dsDNA，导致自身免疫病的发生。自身抗体可由多克隆B细胞增生和抗原致B细胞活化和选择而产生。但机体产生抗天然dsDNA抗体极为困难，出现的抗DNA抗体多是针对变性DNA的抗体。因此抗DNA抗体形成和自身免疫病的产生似不可能为摄入质粒DNA的结果。（3）长期表达外源抗原可能产生的不良后果。核酸疫苗和其他疫苗一样，初免效果是一个重要问题，基因疫苗表达的抗原在新环境下提高时，可能不诱导适当的免疫应答或者在长期表达的情况下有可能诱导免疫耐受；（4）低水平分泌的免疫原可能持续被低水平抗体清除从而使最终免疫应答不足；但如果长期高水平表达，可诱导超免疫状态，使个体处于免疫抑制，易受其他病原体感染，同时必须考虑自身攻击的可能性，CTL可导致表达细胞和周围细胞破坏。

总之，尽管基因疫苗具有许多优点，引起人们的极大兴趣，但必竟历史很短，基因疫苗的许多问题，包括其作用机理和安全性问题需要进一步探讨，如果这些问题能够得到解决，再加上基因枪疫苗接种是目前最有效的接种方法，能够解决注射疫苗的费时费力和需要反复注射的问题，那么基因疫苗就会成为疫苗的新希望导致疫苗领域一场新的革命。