浅谈洗板对ELISA试验的影响

2018年11月14日，我中心实验室进行犬细粒棘球绦虫粪抗原检测试验。试验由2名实验员操作，另有3名见习实验员辅助。犬细粒棘球绦虫抗原检测试剂盒（批号：Eg-Ag20180620）由上级单位统一配发。274份犬粪样品事先经-70℃冷冻一周处理，试验当日室温解冻后每份取1 g样品，加1 ml样品处理液，4 000 rpm离心15 min待用。试验用仪器：酶标仪正常，培养箱正常，96孔自动洗板机开机冲洗管路正常。实验员甲操作A、B两块包被板184份样品的试验，实验员乙操作C块包被板90份样品的试验。试验过程严格按着试剂盒说明书逐步进行，洗板过程中习惯性的同一方向放入包被板，合上盖子洗板，未察觉异常。

试验结束，结果均成立。但三块包被板之间出现非常相似的阳性结果，即A、B、C各板的D—12、E—12、G—12三孔均显阳性（另有A板B—12孔为阳性），且C板G—12孔无样品仍显阳性。这样的结果引起我们的注意，回忆操作过程未出现遗漏、失误，检查洗板机发现D—12、E—12、G—12对应的针孔堵塞，不出液体。这样能解释为什么不同的人操作不同的反应板出现高度相似的结果，且无样品孔也出现阳性。

查出问题后，疏通洗板机针孔，随即对全部样品按原样进行复检，结果为A板B—12孔为阳性，有异议的各板D—12、E—12、G—12三孔均显阴性（其中C板G—12孔无样品）。

该试验由抗细粒棘球绦虫特异性抗体包被的微孔板和酶标记抗棘球绦虫特异性抗体，以双抗体夹心法检测犬粪便中细粒棘球绦虫抗原。试验中，加入待检样品，经过温育后，若样品中含有细粒棘球绦虫抗原，则与包被板上的抗体结合，经洗涤后除去未结合的抗原，再加入酶标记物，与包被板上的抗体-抗原复合物结合形成抗体-抗原-酶标记物复合物，经洗涤除去未结合的酶标记物，在微孔中加入显色液，经酶催化形成的蓝色信号与样品中的抗原含量成正比。

本次试验中由于洗板机的故障，洗板过程中个别孔洗涤不充分或未得到洗涤，使得微孔中的酶标记物留存，导致加入显色液后，酶催化底物成为有色产物而最终显阳性。

洗涤在ELISA试验过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着试验的成败。洗板达到分离游离的和结合的酶标记物的目的，清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质，以供最终检测。笔者认为在ELISA试验过程中，洗涤对试验的影响主要有以下几点（除去本次试验中洗板机针孔堵塞情况）。

一、注液量

如果试验结果出现较多的假阳性，可以怀疑是洗板未洗干净造成的，那么就需要将注液量调大，最好是注满整个孔。注液量太少洗不到微孔较高的位置，而这些位置可能也有残留的待检测物质，从而使最终结果出现假阳性。ELISA微孔板的厂家一般会在试剂盒的说明书中写明建议使用的注液量（300 µl）。一般来说，注液量越大，则残留的抗体或抗原量就越少。增大注液量最直接的方法是注入过量的洗涤液，现有先进的洗板机会有防溢液功能，当注液过量时多余洗液会自动被吸走，不会流到板架和仪器内。

二、洗板次数和洗板强度

第二个影响洗涤效果的主要参数是洗板次数和洗板强度。洗板次数越多，洗板强度越大，残留量也就越低。但是洗板次数过多或洗板强度过大可能会破坏已包被的固相载体，反而使检测结果不准确。有时候也会遇到一些特殊情况的试剂，比如游离的物质吸附性较强，较难洗净，这时就需要增大洗板强度或洗板次数；或者恰恰相反，参与结合的固相载体不是特别牢固，容易被冲洗掉，这时就需要减弱洗板强度或减少洗板次数。通常ELISA微孔板的厂家也会在说明书中注明建议的洗板次数。

三、吸液高度和吸液位置

最后一个影响洗板效果的参数就是吸液高度和吸液位置，吸液高度会明显影响残留量，如果吸头与反应孔底部的距离稍大，那就会让残留量急剧增加。反之，如果吸头压着反应孔底部，液体比较难进入吸头，那么也会使吸液效率降低，残留量增加。大多数洗板机会使用浮动的洗板头，这种洗板头有一定的自由调节空间，下降到微孔底部，接触后会自然顶起一部分，不需要根据不同的微孔板设置不同的吸液高度，而是直接下降到微孔底部进行吸液。

吸液的位置也对残留量有着重要影响。如果每个孔只使用一个抽吸点，也就是一点吸液，那么吸液的位置是非常重要的。这个位置最好设置在微孔的中间位置，这样整个孔中的液体抽吸过程比较均匀。还有的厂家设置为两点吸液，就是在孔中心与孔壁之间的某处取前后两点进行吸液，使残留量降到最小。

本次试验由于人员的疏忽导致出现假阳性的结果，也警示实验室人员在实验过程中对于每一步都要严谨、细致。并且在洗板过程中不要随意更改说明书中建议的洗板参数。