生物大分子载体在肿瘤纳米靶向药物研发中的应用研究进展

董丽娜，蔡璐璐，赵明明，张秀莉，李梦双，窦宾茹，解婷，徐凯，李菁菁

(1徐州医科大学医学影像学院，江苏徐州 221004；2徐州医科大学附属医院)

精确诊断和有效的药物传递一直是癌症治疗领域的研究热点，以纳米颗粒为基础的诊疗平台可通过主动和被动靶向进行精确诊断和有效给药[1]，但是纳米材料的毒性和不可降解性也限制了其作为药物载体的应用。生物大分子作为生物体内的天然活性成分，具有良好的内在生物化学和生物物理特性，在半衰期、稳定性、安全性和制造易用性等方面均表现出潜在的优势；将生物大分子与纳米材料相结合可以显著提高纳米材料的生物相容性，并且生物大分子可通过识别特异性受体而实现主动靶向功能。因此，生物大分子在纳米药物载体的构建、靶向纳米药物的制备等方面均具有良好的发展前景。蛋白质、多糖及脂类是目前应用最广泛的生物大分子，作为载体应用于纳米药物不仅能改善化疗药物的水溶性、稳定性，还能进一步实现通过温度、pH或空间控制的方式智能释药，除此之外还可凭借自身特异性靶向配体实现靶向给药。本文对蛋白质、多糖、脂类等生物大分子作为载体在肿瘤靶向治疗相关纳米药物中的应用作一综述。

1 蛋白质

1.1 白蛋白 白蛋白是人体内最丰富的血浆蛋白，具有维持胶体渗透血压和运送金属离子、不溶性小分子、营养素到各组织器官等作用，目前研究较为广泛的是人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)。HSA、BSA均具有良好的水溶性，而且分子量相近[2]，BSA的高同源性和低成本使其成为相关研究中HSA的合适替代物。由于白蛋白的粒径约为7.2 nm，高于肾清除阈值，因此白蛋白的血浆半衰期比其他小分子长，平均19 d。白蛋白作为一种天然的生物大分子，凭借其良好的生物相容性、长血浆半衰期而被视为理想的药物载体。白蛋白结合型药物进入细胞后，白蛋白可降解为氨基酸，为周围的组织和细胞提供营养，而释放出来的游离药物则发挥治疗作用[3]。

早在2005年，美国食品药品管理局(FDA)已批准白蛋白结合型紫杉醇用于乳腺癌的治疗，该纳米药物是由紫杉醇与白蛋白通过疏水作用形成的，是FDA批准的第一个用于乳腺癌治疗的纳米药物[4]。以白蛋白为药物载体制备纳米药物主要通过共价结合和非共价结合两种方式实现，其中非共价结合包括包封、疏水作用、化学配位和静电相互作用等，部分学者成功地将米托蒽醌、多柔比星(DOX)、5-氟尿嘧啶等化疗药物通过上述作用与白蛋白相连[5]。除了与一般化疗药物连接外，由于白蛋白富集N-端和半胱氨酸残基，使其与过渡金属离子如Au3+、Cu2+、Gd3+和Bi3+具有较强的配位能力[6]。You等[7]构建了BSA包覆中空金纳米壳(Au@BSA-Gd)的多功能纳米材料，同步实现光热治疗和计算机断层扫描/光声成像相结合。Ding等[8]以BSA为模板合成具有良好荧光性能的BSA@Au NCs，并利用环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)对其进行修饰，利用双官能团交联剂spdp既可与BSA反应生成吡啶基又可与DOX-SH共轭形成双硫键的特性，得到诊疗一体化纳米探针DOX/cRGD-BSA@Au NCs。该二硫键可被肿瘤细胞内过量表达的谷胱甘肽(GSH)破坏，释放出DOX，达到靶向治疗的目的。因此，白蛋白成为目前研究最广泛的生物大分子载体，已成功应用于临床。

1.2 转铁蛋白(TF) TF是一种具有储存和代谢铁元素的多功能蛋白，对血管生成、增殖和免疫抑制具有重要作用。转铁蛋白受体(TFRs)是一种跨膜糖蛋白，其主要作用是通过与转铁蛋白靶向结合介导铁的吸收。研究发现，一些恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、结肠癌和脑癌等细胞中TFRs高度表达，这是由于癌细胞在生长、DNA合成、分化和再生过程中需要大量铁的缘故;并且与正常细胞相比，TFRs在癌细胞中表达升高了近100倍[9]。因此，TF可用作药物传递系统中的靶向配体。Chen等[10]利用高压均匀化法制备了转铁蛋白和叶酸共同修饰的蟾毒灵纳米脂质体，实现了肺癌的双靶向治疗作用;而且经TF修饰后，脂质体稳定性得到提高，有效避免了纳米脂质体的非特异性、快速药物释放等缺点。

由于血脑屏障的存在，很多化疗药物无法进入颅脑肿瘤内部，导致化疗药物的治疗效果大大降低。而TFRs是影响血脑屏障的主要蛋白之一，因此可以将化疗药物与转铁蛋白结合，通过受体介导的胞吞作用，穿过血脑屏障进入肿瘤内部[11]。Jhaveri等[12]将白藜芦醇(RES)装载到聚乙二醇化脂质体(RES-L)中，并将该脂质体表面修饰转铁蛋白分子形成靶向药物TF-RES-Ls;与游离RES或RES-L相比，TF-RES-Ls对胶质母细胞瘤(GBM)细胞具有更强的细胞毒性和诱导细胞凋亡的能力。该研究对皮下种植GBM细胞的裸鼠模型进行靶向药物TF-RES-Ls的疗效评估，结果表明TF-RES-Ls在抑制肿瘤生长和提高裸鼠存活率方面比其他治疗方案更有效。

但是有研究指出，TF的半衰期仅为8 min，TF可被迅速循环回到细胞表面并释放[3]。如果TF与药物分子之间连接的化学键在这8 min内不能在细胞内被破坏，其负载的药物将随TF一起出胞，导致细胞内游离药物浓度降低，细胞毒性降低。因此，如何延长TF修饰纳米药物的半衰期是需要重点考虑和解决的问题。

1.3 脂蛋白 脂蛋白是体内重要的蛋白质之一，主要由载脂蛋白、磷脂、TG和TC组成，TG和TC组成中心疏水核，外围包被的载脂蛋白及磷脂组成亲水基团。根据脂类、载脂蛋白的类型、密度及大小，可将脂蛋白分为5类：乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。脂蛋白主要参与TC和其他疏水分子在血液中的转运，通过识别其特异性受体进入细胞。由于TC和脂肪酸水平的提高对多种肿瘤细胞的生存和快速增殖至关重要，在一些恶性肿瘤细胞中，特别是急性骨髓性白血病(AML)、直肠癌、肺癌、脑癌、转移性前列腺癌细胞中脂蛋白受体过量表达[13]。因此，脂蛋白可被作为一种天然的内源性靶分子。LDL和HDL是脂蛋白的两个主要类型，目前被广泛应用于肿瘤的靶向治疗。Shi等[14]制备出氨基化二氧化硅纳米粒子，通过静电吸附作用与脂蛋白相连，经过修饰的纳米粒子可装载阿霉素用于直肠癌的靶向治疗。

但是LDL结构中多含有超过45%的胆固醇酯疏水核心，血液中过量的TC会促进动脉粥样硬化斑块的形成，增加心脑血管疾病发生的危险。因此有学者尝试对LDL的疏水核心重构，代之以脂肪酸[15]等无害物质。但是由于大多数正常组织及细胞中均存在LDL受体，LDL载体修饰的纳米药物可能被正常组织吸收，从而增加药物的不良反应；且LDL的溶酶体代谢途径可能导致药物分解，使LDL用于靶向药物的传递作用受到限制。与LDL不同， HDL的受体是清道夫受体B类Ⅰ型(SR-BⅠ受体)，HDL可通过SR-BⅠ受体途径而非溶酶体分解途径，有效地将药物转运至细胞质。而且，HDL被认为是血管内脂质的清道夫，具有抗动脉硬化的作用，故研究者们逐渐将重点投向HDL。Han等[16]将HDL与非甲基化寡核苷酸(CpG ODN)及AS1411适配体相连，使其具备特异性识别肿瘤细胞和核蛋白的双靶向功能，随后将DOX插入到CpG的CG碱基对中；CpG ODN可通过激活抗原提呈细胞(巨噬细胞和树突状细胞)，导致TNF、白细胞介素-6(IL-6)、IL-12等促炎因子表达升高，产生免疫刺激作用，最终同步实现化疗及免疫治疗。

但是大量分离获取天然HDL和LDL非常困难，并可能存在微生物感染的风险。为了解决这一问题，部分学者已成功制备出具有脂蛋白受体识别功能的模拟肽[17]，无疑为以脂蛋白为载体修饰的靶向药物传递系统的进一步研究和应用提供了新思路。

2 多糖

2.1 壳聚糖(CS) CS是由甲壳素通过脱乙酰作用得到的天然线性生物多糖，其基本结构单元由氨基葡萄糖和N-乙酰胺基葡萄糖组成，这种结构使CS中存在着大量游离的氨基[18]。游离的氨基不仅使CS带有正电荷，还可以作为CS化学结构修饰的靶点，通过引入不同基团和配体的方式制备一系列CS衍生物，从而提高CS的水溶性，增强相关生物活性[19]。多数阴离子药物与带正电荷的CS之间会发生强烈的电荷作用，形成交联聚合物，这种交联聚合物具有较为稳定的结构，有利于延长药物释放周期，以达到缓释、控制释药的目的[20]。Song等[21]制备了磁性海藻酸钠/壳聚糖纳米粒子用于乳腺癌的靶向治疗，体外释放结果显示，纳米粒子中的姜黄素(Cur)在前两天内释放较快，随后释放变慢；前两天释放速度较快的原因很可能是纳米粒子表面或靠近粒子表面的Cur分子丢失所致，两天之后Cur的释放取决于粒子内部Cur分子通过聚合物基质向PBS溶液扩散的速度，由于形成的聚合物基质结构致密，所以Cur释放较为缓慢。

除了作为缓释药物载体外，CS由于富含氨基而对pH具有高度敏感性，不同pH可诱导CS链上氨基(-NH2)的质子化/去质子化，从而改变溶胀率，影响药物释放[21]。消化道的pH从胃的1～3到小肠的6～7.5不等，pH变化可用来控制药物释放。对pH敏感的聚合物胶束可保护药物在胃肠道上部不被破坏，实现以空间控制的方式释放药物。Woraphatphadung等[22]通过透析法成功制备出载药率较高的Cur-CS-聚合胶束，并用于结肠癌的靶向治疗，该胶束与不同pH的介质接触后形态发生变化，间接证实胶束的pH敏感性；该研究显示，在模拟胃液(pH 1.2)中，胶束累积释放Cur的百分比控制在20%左右，但在模拟肠液(pH 6.8)和模拟结肠液(pH 7.4)中，胶束Cur累积释放量明显增加，表明对pH敏感的CS-聚合胶束有望成为结肠靶向给药的理想载体。

2.2 透明质酸(HA) 与CS类似，HA是经5β-胆汁酸修饰的酸性黏多糖，广泛存在于细胞基质中。HA由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺交替单元组成，通过交替的β-1，4和β-1，3-糖苷键连接在一起，其分子中有4个化学修饰位点，分别是羧基、羟基、N-乙酰氨基和还原末端，羟基和羧基是常用的修饰位点，可利用酯化、酰胺化、静电作用等方法对其修饰,从而改善其性能。HA降解速度很快，机体通过透明质酸酶可将基质中的HA降解为无毒的CO2和H2O。HA无抗原性，可存在于任何一种生物体内，无物种和组织差异性，最重要的是HA可以与许多肿瘤细胞表面过表达的CD44受体特异性结合。因此，目前HA已被作为靶向配体用于癌症治疗[23]。此外，HA可在纳米粒子表面形成亲水层，保护其不被降解，从而延长HA修饰纳米粒子的体内循环时间。Teijeiro-Valino等[24]将HA与肿瘤归巢穿膜肽Lyp1(tLyp1)结合作为纳米外壳，包埋油性核，并证实该纳米载体所负载的药物在原位肿瘤及淋巴系统均出现富集，在扼制原位肿瘤生长的同时,也抑制了肿瘤的淋巴转移。

除了通过特异性识别CD44受体实现靶向功能外，由于HA可被透明质酸酶水解，一些学者利用该原理构建基于HA的纳米载体，实现肿瘤微环境的药物释放。近年来，能够对温度、pH、氧化还原反应、光辐照、酶及特定物质(如过氧化氢[25])等外界和内部刺激作出反应的智能药物递送纳米系统被认为是最理想的药物载体，封装在这些系统中的药物可以在指定的地点和时间,以期望的速度进行释放。Xu等[26]成功开发了一种新型的多功能纳米探针金纳米棒(GNRs)-HA-光敏剂5-氨基乙酰丙酸(ALA)/显像剂(Cy7.5)-HER2，实现了双靶向给药、三重刺激药物释放、近红外成像联合PDT/PTT治疗HER2阳性乳腺癌；该纳米探针在血液循环中表现出良好的稳定性，GNRs、HA、ALA及Cy7.5所构建的纳米平台能够应对pH、GSH和透明质酸酶三重刺激触发的药物释放行为。HA作为细胞外基质的主要成分之一，在医学领域展现了较好的应用潜能，但大多数研究仍处于体外试验阶段，体内研究报道较少，而且HA生产工艺复杂，工业化难度大。因此，HA作为药物载体的产业化和广泛临床应用仍需进一步研究。

3 脂类

目前，临床上常用的化疗药物大多数为疏水性，由于水溶性差、 渗透性低等原因，导致其生物利用度低。脂类作为人体所需的重要营养素之一，虽然种类繁多，但其分子结构具有共同的特点，即均具有亲水和疏水两部分，这样的结构特点使其在水相中会形成团粒或片状双层结构。脂类的极性头部通过静电引力对水有亲和力，因而面向水；而疏水的尾部则互相聚集，避开水相，游离的两端有自动闭合趋势。脂质本身的理化特性和热力学特点使其在水溶液中能够保持稳定，可作为疏水性化疗药物的理想载体。目前临床上应用最广泛的是脂质体。脂质体作为载体具有细胞样膜结构，能够保护药物或活性基团，延长药物半衰期，载药脂质体可以通过滞留效应在肿瘤组织中积累。在健康组织中，小分子药物很容易从血管外渗出来，载药脂质体由于直径较大而无法排出。肿瘤血管中存在异常宽的裂孔，可允许脂质体的外渗，最终使化疗药物在肿瘤组织富集。但是由于脂质体表现为正电荷，进入体循环后易与负电性的血浆蛋白相互作用，并被单核-巨噬细胞系统(MPS)摄取，最终蓄积于肝脏和脾脏等器官中。显然，这一现象不仅减少了药物在靶组织(非MPS相关组织)的分布，而且还会对肝、脾等脏器造成损伤。为了解决这一问题，一些学者考虑屏蔽脂质体的正电荷，由此改良后的聚乙二醇化脂质体阿霉素于1994年11月被FDA批准用于临床应用，成为第一个纳米级抗癌药物[27]。在此基础上，Sesarma等[28]将长循环脂质体阿霉素进一步包封Cur，改良后的脂质体制剂具有良好的抗肿瘤作用。

为了获得更好的脂质体传递系统，许多学者在经典脂质体分子的基础上进行结构修饰和表面修饰，生成具有特定生物效应的新型脂质体，包括特异性靶向脂质体、环境敏感脂质体、多功能脂质体等，大大扩展了脂质体在生物医学中的应用。在癌症治疗中，化疗药物经常会遇到药物转运蛋白如P-糖蛋白(P-gp)过表达诱导的多重耐药现象。Chen等[29]开发了一种新型脂质体系统，该系统在生理条件(pH 7.4)下带负电荷，可显著延长循环时间；在肿瘤微环境(pH 6.5)中,该脂质体系统可反转为正电荷，促进肿瘤细胞摄取和细胞内药物积累。还有一部分学者构建温敏性脂质体[30]，该脂质体通过激光加热装置、提高孵育温度及磁共振引导的高强度聚焦超声等提高局部温度，控制药物释放，从而减少化疗药物对正常组织的毒性作用，并增强肿瘤内化疗药物的峰值浓度。自1985年第一种脂质体包囊药物进入临床试验阶段以来，已有40多种脂质体包囊药物成功上市,或处于不同的临床研究阶段。随着科学技术的发展，相信越来越多的高效脂质体载体将被广泛应用于临床，在各种肿瘤疾病的治疗中发挥重要作用。

综上所述，生物大分子作为生物体内的天然活性成分，具有良好的生物相容性、易降解、血浆半衰期长、低免疫原性等优点，是理想的药物载体。研究人员利用共价、非共价结合(包埋封装、疏水作用、静电吸附)和表面修饰活性基团等方法[31]，开发了基于生物大分子为载体的多功能纳米载药系统，并取得了满意进展。两种或两种以上生物大分子的联合应用也越来越受到人们的关注，但是利用其进行药物传递并不能与体外保持完全相同的特性，且各类结合方式的引入可能会对生物大分子固有的理化特性造成影响。目前为止，只有少数几种以生物大分子为载体的纳米靶向药物被批准用于临床。未来仍需通过合理设计构建更加完善的生物载药系统，加快研究成果从实验室到临床的转化，以满足临床需求。