体外受精－胚胎移植中移植不同培育时间、单双胚胎的不孕症患者受孕及妊娠结局观察

李翔，曾莠蔓，罗宇迪，张炬光，罗博文，何娟，贾俊龙

(1玉林市妇幼保健院，广西玉林，537000;2中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院)

不孕不育是与工作压力和生活环境等因素相关的疾病。近年，不孕不育发病率逐渐升高，且发病年龄趋于年轻化。迄今为止，体外受精－胚胎移植技术(IVF－ET)是治疗不孕不育最有效的医疗手段，但是使双胎妊娠及多胎妊娠等不良妊娠结局发生的概率增加，产妇及新生儿并发症发病率升高［1]。因此，选择移植胚胎的发育天数和减少胚胎移植的数量，在不影响患者受孕率的同时降低多胎妊娠的发生率受到越来越多的关注。部分研究者认为延长体外培养天数至囊胚移植，其受孕率优于卵裂期胚胎［2]，但是有研究者认为卵裂期胚胎移植也可以达到良好的妊娠效果［3]。对于移植胚胎数量的选择，研究者认为采用单胚胎移植可以有效减少多胎妊娠的发生［4，5]。本研究通过分析移植胚胎的发育天数和数量对妊娠结局的影响，以期为临床应用提供有效的参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2016年7月～2018年2月间于本院生殖医学中心行常规体外受精/卵胞浆内单精子注射—胚胎移植(IVF/ICSI－ET)助孕治疗的不孕不育患者1 719例为研究对象。纳入标准：年龄＜38岁;无遗传性及家族性病史;不孕原因为盆腔输卵管因素和男方因素。排除标准：存在习惯性流产史;存在子宫畸形、合并子宫肌瘤、子宫腺肌症;卵巢功能减退者。本研究经本院伦理委员会批准同意，纳入者均签署知情同意书。

1.2 IVF/ICSI－ ET方法 ①促排卵：纳入者均行黄体期长方案或卵泡期长方案，B超检测卵泡发育情况，当主导卵泡2个＞18 mm或3个＞18 mm，雌二醇＞150 mg/卵时，肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)10 000 IU，注射36 h经阴道超声采卵。②授精及胚胎培养：将取卵+受精日记为第0日(D0)、胚胎培养第1天记为D1。D3挑选1～2个优质胚胎移植或冷冻、剩余3级以上的胚胎转至预先平衡好的囊胚培养液微滴中进行培养。D5、D6分别观察囊胚形成情况及形态。③胚胎质量观察：D3观察胚胎发育情况，胚胎评级1、2级胚胎为优质胚胎。D5、D6按照Gardner评分系统对囊胚进行质量评级，可利用胚胎定义为3期以上，内细胞团及滋养层细胞不同时为C级。④胚胎移植新鲜胚胎移植移植D3期卵裂胚和D5期囊胚，冻融胚胎移植移植D3期卵裂胚、D5期和D6期囊胚。新鲜胚胎移植选择1～2枚3级以上D3期胚胎进行移植或者冷冻;选取1～2枚D5可用囊胚以上的囊胚新鲜移植或者冷冻，D6形成囊胚只冷冻不进行新鲜移植。胚胎冷冻和解冻均采用玻璃化快速冷冻解冻方法，胚胎冷冻液和胚胎解冻液购于日本加藤(10101、10102)。单胚胎移植可进行新鲜胚胎移植(D5囊胚、D3胚胎)、冻融胚胎移植(D3胚胎、D5胚胎、D6胚胎)移植，双胚胎移植可进行新鲜胚胎移植(D5囊胚、D3胚胎)、冻融胚胎移植(D3两枚胚胎、D5两枚胚胎、D6两枚胚胎)移植。新鲜胚胎移植胚胎移植标准：获卵数较多且有卵巢过度刺激综合征(OHSS)倾向不移植。年龄＜38岁，获卵数不多且无卵巢过度刺激综合征(OHSS)倾向，移植1～2枚D3胚胎或者D5囊胚。冻融胚胎移植优先移植优质囊胚，然后D3优质胚胎。

1.3 受孕及妊娠结局观察 移植后观察各组妊娠结局(生化妊娠、临床妊娠)：移植后14、18检测外周血B－hCG阳性［5]可判定为生化妊娠。临床妊娠：移植后第35天行腹部B超观察子宫腔内孕囊数目和心管搏动情况，测算临床受孕率、种植率、异位妊娠率、流产率、多胎率。临床受孕率=临床妊娠周期数/移植胚胎周期数×100%，种植率=B超下见到孕囊数/移植胚胎数×100%，异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%，流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%，多胎率=多胎妊娠周期/临床妊娠周期数×100%。

1.4 统计学方法 采用SPASS24.0统计软件进行处理。多组计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One－way ANOVA)，两两比较采用SNK－q检验;定性资料中 %比较采用χ2检验，若有一个格子的理论频数＜5则用 Fisher’s确切概率法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

1 179例患者中，单胚胎移植的新鲜胚胎移植中D3胚胎者66例、D5囊胚者29例，冻融胚胎移植移植中D3胚胎者56例、D5胚胎者23例、D6胚胎者40例。双胚胎移植的新鲜胚胎移植中D3胚胎者747例、D5囊胚者31例，冻融胚胎移植移植中D3胚胎者561例、D5胚胎者121例、D6胚胎者45例。

新鲜胚胎移植D3单胚胎移植者的年龄(33.03±4.00)岁，BMI(22.59 ± 3.13)Kg/m2，不孕(5.15±3.95)年，既往胚胎移植(1.23 ±0.46)周期，基础FSH(5.91 ± 1.61)IU/L、Gn 总量 (2 310.61 ±713.34)IU、Gn 使用(10.70 ±2.36)d、获卵数(9.73±4.03)个、内膜厚度(10.36 ±2.10)mm、临床受孕率25.76%(17/66)、种植率 25.76%(17/66)、流产率29.41%(5/17)、异位妊娠率 5.88%(1/17)、多胎率0;新鲜胚胎移植D5单胚胎移植者的年龄(31.41 ±4.32)岁，BMI(22.43 ±3.12)Kg/m2，不孕(3.69 ±2.52)年，既往胚胎移植(1.17 ±0.54)周期，基础 FSH(5.30 ±1.80)IU/L、Gn 总量(2 337.93 ±399.14)IU、Gn 使用(10.90 ±2.70)d、获卵数(10.10 ±2.60)个、内膜厚度(10.33 ±1.96)mm、临床受孕率 51.7%(15/29)、种植率 51.7%(15/29)、流产率 6.67%(1/15)、异位妊娠率 0、多胎率0。与新鲜胚胎移植D3单胚胎移植者比较，新鲜胚胎移植D5单胚胎移植者临床受孕率、种植率升高，流产率降低(P均＜0.05)。冻融胚胎移植D3单胚胎移植者的年龄(32.68 ±3.87)岁，BMI(22.35±2.80)Kg/m2，不孕(3.79 ±2.15)年，既往胚胎移植(1.85 ±0.49)周期，基础 FSH(5.64 ±2.50)IU/L、内膜厚度()mm、临床受孕率21.43%(12/58)、种植率21.43%(12/58)、流产率 16.67%(2/12)、异位妊娠率0、多胎率0;冻融胚胎移植D5单胚胎移植者的年龄(32.09 ± 4.59)岁，BMI(21.66 ± 5.55)Kg/m2，不孕(4.13 ±1.91)年，既往胚胎移植(1.83±0.58)周期，基础FSH(6.06 ±2.81)IU/L、内膜厚度(9.65+1.62)mm、临床受孕率60.08%(32/53)、种植率54.24%(32/59)、流产率0、异位妊娠率0、多胎率10.08%(3/30);冻融胚胎移植D6单胚胎移植者的年龄(33.25 ±3.33)岁，BMI(22.48 ±2.55)kg/m2，不孕(4.68 ±2.68)年，既往胚胎移植(1.95±0.50)周期，基础FSH(5.81 ±1.59)IU/L、内膜厚度(9.98 ±2.02)mm、临床受孕率30.00%(12/40)、种植率 30.00%(12/40)、流产率 25.00%(3/12)、异位妊娠率0、多胎率0。与冻融胚胎移植D3、D6单胚胎移植者比较，冻融胚胎移植D5单胚胎移植者临床受孕率、种植率升高(P均＜0.05)。

新鲜胚胎移植D3双胚胎移植者的年龄(31.35±3.80)岁，BMI(21.85 ± 3.03)Kg/m2，不孕(4.45±3.06)年，既往胚胎移植(1.15 ±0.45)周期，基础FSH(5.58 ±1.41)IU/L、Gn 总量 (2267.49 ±764.64)IU、Gn 使用(11.27 ± 2.15)d、获卵数(10.73 ±4.42)个、内膜厚度(10.15 ±1.75)mm、临床受孕率 56.49%(422/747)、种植率 38.22%(571/1494)、流产率 2.09%(46/422)、异位妊娠率2.84%(12/422)、多胎率 34.36%(145/422);新鲜胚胎移植D5双胚胎移植者的年龄(31.90±3.72)岁，BMI(22.37 ± 3.06)Kg/m2，不孕(4.35 ± 3.32)年，既往胚胎移植(1.23±0.56)周期，基础 FSH(5.31 ±1.86)IU/L、Gn 总量 (2174.73 ±774.79)IU、Gn 使用(11.13 ±2.20)d、获卵数(10.48 ±2.93)个、内膜厚度(10.04 ±1.69)mm、临床受孕率74.19%(23/31)、种植率 59.68%(37/62)、流产率4.35%(1/23)、异位妊娠率 0、多胎率 30.43%(7/23)。与新鲜胚胎移植D3双胚胎移植者比较，新鲜胚胎移植D5双胚胎移植者种植率、受孕率升高(P均 ＜0.05)。

冻融胚胎移植D3双胚胎移植者的年龄(31.93±3.70)岁，BMI(21.85 ± 3.06)Kg/m2，不孕(3.98±2.04)年，既往胚胎移植(2.13 ±0.50)周期，基础FSH(5.80 ±2.27)IU/L、内膜厚度(9.48 ± 1.49)mm、临床受孕率47.59%(267/561、种植率 32.80%(368/1122)、流产率16.48%(44/267)、异位妊娠率6.35%(17/267)、多胎率 36.33%(97/267);冻融胚胎移植D5双胚胎移植者的年龄(31.63±3.25)岁，BMI(22.58 ±3.22)Kg/m2，不孕(3.92 ±1.92)年，既往胚胎移植(2.16 ±0.56)周期，基础 FSH(5.95±2.08)IU/L、内膜厚度(9.51+1.50)mm、临床受孕率 76.03%(92/121)、种植率 59.92%(145/242)、流产率 4.35%(4/92)、异位妊娠率 3.26%(3/92)、多胎率55.43%(51/96);冻融胚胎移植D6双胚胎移植者的年龄(31.20 ±4.12)岁，BMI(22.59±2.85)kg/m2，不孕(3.81 ±2.46)年，既往胚胎移植(2.20 ±0.73)周期，基础 FSH(5.53 ±1.32)IU/L、内膜厚度(9.56 ±1.36)mm、临床受孕率 51.11%(23/45)、种植率 41.11%(37/90)、流产率 0、异位妊娠率0、多胎率8.69%(2/23)。与冻融胚胎移植D3、D6双胚胎移植者比较，冻融胚胎移植D5双胚胎移植者临床受孕率、种植率、多胎率升高(P均＜0.05);与冻融胚胎移植D3双胚胎移植者比较，冻融胚胎移植D6双胚胎移植者临床受孕率、种植率升高，多胎率、流产率降低(P均＜0.05);与冻融胚胎移植D3双胚胎移植者比较，冻融胚胎移植D5双胚胎移植者异位妊娠率升高(P＜0.05)。

3 讨论

近年来，随着辅助生殖技术的发展和胚胎培养条件的成熟，IVF中心倾向于对患者胚胎行囊胚培养，在胚胎发育到第5或6天移植1～2枚优质囊胚［2，4]。但是，囊胚培养延长了胚胎在体外暴露的时间，胚胎质量、卵母细胞质量及培养环境等均可影响囊胚形成，可能会造成无胚胎可用的情况［6]。因此，选择在受精后第3天移植1～2枚8细胞以上的优质胚胎，可以减少取消移植周期的风险。有研究报道，卵裂期胚胎移植期受孕率和种植率与囊胚移植无明显差异［3]。本研究中，我们新鲜胚胎移植选择移植1～2枚第3天优质期卵裂期胚胎或者选择移植第5天1～2枚可用囊胚;冻融胚胎移植优先选择D5囊胚移植，D6和D3优先选择优质胚胎移植。结果显示，在新鲜胚胎移植和冻融胚胎移植中，囊胚移植其受孕率和种植率均高于卵裂期胚胎移植，其中D5囊胚优于D6囊胚，这与国内外多项研究［4，7]结果一致。可能的原因：①在正常生理状态下，4～8细胞的卵裂期胚胎处在输卵管中，而囊胚期胚胎才迁移至子宫内着床，所以移植囊胚符合内膜容受性［8];②发育速度较快的胚胎其存活能力更高，胚胎的发育速度较快其发育潜能可能更高，所以D5囊胚受孕率更高［9];③发育潜能较差的胚胎可能停滞在基因组激活的卵裂期阶段，体外继续培养后能够形成的囊胚，其染色体异常的比例更低，D3卵裂胚可能部分停滞发育［10];同时，本研究结果显示，移植2枚D3卵裂期胚胎可以获得高达53%的受孕率和较高种植率，但是存在较高的多胎率。因此，对于获卵数较多的患者胚胎进行囊胚培养，优先选择D5囊胚进行移植，对于获卵数较少的患者可以选择2枚D3优质卵裂期胚胎移植，获得较好的临床效果。

早期IVF－ET通常选择移植2～3枚优质胚胎，以便增加患者受孕率。但是，这种片面追求受孕率的提高，已不适应当前辅助生殖技术发展的需要。有研究报道，多胚胎移植显著增加多胎妊娠发生的概率，而多胎妊娠增加了产妇高血压、不足月产和早产的概率，低体重儿和脑瘫患儿的概率也随之增加，降低多胎妊娠的最佳手段是单胚胎移植，可明显降低双胎率的同时获得更好的产科结局［11，12]。黄志辉等［13]对D3选择性单胚胎移植的围产结局分析发现，D3双胎移植受孕率显著高于单胎移植，但是两组间种植率无差异，单胎移植明显降低多胎妊娠的发生，获得更好的妊娠结局。本研究通过对D3卵裂期单胚胎和多胚胎移植进行对比发现，D3双胚胎移植受孕率可达47%～54%，单胚胎移植受孕率仅为21%～26%，但是D3双胚胎移植多胎率高达30%以上，单胚胎移植未发现多胎妊娠。可能的原因有：卵裂期胚胎内在质量可能直接决定其发育潜能，从而影响胚胎移植后的临床结局［14];胚胎发育到4～8细胞期存在明显阻滞现象，双胚胎移植增加了突破阻滞的机率。

单囊胚移植临床受孕率和活产率较高，且多胎率、异位妊娠率及卵巢过度刺激发生率较低，但是选择不同发育阶段(D5和D6)和数量的囊胚移植，临床妊娠结局存在差异。Yang等［15]研究发现，D5囊胚临床受孕率和着床率高于D6囊胚，但是D5和D6优质囊胚临床结局差异无统计学意义。陈清汾等研究发现D5囊胚受孕率高于D6囊胚，滋养层评分高的D5囊胚可以提高受孕率，降低流产率［16]。Gardner等［4]研究发现单囊胚与双囊胚移植的临床受孕率分别为60.9%、76.0%，两组比较差异无统计学意义，但是单囊胚移植患者的多胎受孕率为0，显著低于双囊胚移植组的双胎率47.4%。Henman等［17]通过对单囊胚与双囊胚移植进行比较，发现两组间受孕率分别为 65.3%、64.2%，双胎率为7.0%、34.0%。本研究发现D5期囊胚移植受孕率和种植率显著高于D6期囊胚移植，存在统计学意义;双囊胚移植受孕率显著高于单囊胚移植，但是双囊胚移植多胎率(30% ～55%)显著高于单囊胚(0～10%)(缺乏新鲜胚胎移植D6囊胚移植的数据);D5单囊胚移植受孕率可以达到(51% ～56%)，多胎率仅为10%。因此，选择D5单囊胚移植，可以稳定受孕率的同时，降低多胎率的发生。

玻璃化冷冻虽然是可行的技术，但是冷冻因素导致透明带变硬，将会影响胚胎的孵化和着床［18]。文晓凤等研究报道，刺激周期给予全胚冷冻后行解冻移植能够增加患者的临床受孕率及种植率［19]。本研究发现，新鲜胚胎移植和冻融胚胎移植选择D5单囊胚移植，均可以获得良好的临床效果。

综上所述，无论新鲜胚胎移植或冻融胚胎移植，IVF－ET中胚胎发育D5囊胚移植后妊娠结局最佳，可以获得稳定受孕率，减少多胎妊娠的分险。对于获卵数较少的患者可以选择2枚D3优质卵裂期胚胎移植，也可以获得较好的临床效果。