高效液相色谱法检测奶牛血清中脂肪酸浓度测定

钱 坤

（天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心，天津 300402）

高效液相色谱法是一种科学有效的检测方式，在奶牛血清中脂肪酸浓度测定中应用效果显著，可以有效的提升测量的精准度，解决了气相色谱法检测的问题与不足，具有稳定高效的特征。

1 高效液相色谱法检测奶牛血清中脂肪酸浓度测定实验

奶牛在分娩之前2周直至娩之后的10d左右，血浆中脂肪酸浓度会呈现一定的波动变化，一般会在平均0.2mmol/L 逐渐增加到0.75mmol/L左右，而患酮病奶牛血液中的脂肪酸浓度则就会高达1mmol/L左右。脂肪酸代谢紊乱会影响奶牛的胰岛素抵抗以及细胞免疫等问题，通过高效液相色谱法进行奶牛血清中脂肪酸浓度测定，可以为脂肪酸代谢紊乱的控制提供参考与支持。通过气相色谱法进行脂肪酸代谢检测，因为温度高，很容易导致不饱和脂肪酸在检测中出现异构化的问题，随着各种技术手段的成熟，通过HPLC奶牛血清中脂肪酸浓度测定的研究也逐渐增多。

1.1 材料

选择健康奶牛作为试验动物；根据要求进行试剂配制处理。

1.2 血浆脂肪酸提取

将0.25ml血清放入到10ml离心管之中，然后分别添加25μl内标溶液以及1.25ml提取液，对其进行旋涡处理，时间为10min；处理之后添加1ml正庚烷、0.75ml水，对其涡旋处理，时间为5 min。通过 4500r/min 离心处理 5 min，获得上层正庚烷溶液，将其放在4ml玻璃瓶之中，在离心管中添加1ml正庚烷，对其涡旋处理5min，通过4500r/min 离心处理5min，与上层正庚烷溶液进行合并，通过氮气进行吹干获得样品小瓶。

1.3 标准曲线的制备

分别取对照品50μl、100μl、200μl、400μl、800μl工作溶液，将其放在4ml玻璃瓶之中，分别添加25μl的内标溶液，通过氮气将其吹干，获得标准曲线样品小瓶。

1.4 脂肪酸的衍生化

在小瓶中或者标准曲线小瓶中的，加入2-溴苯乙酮丙酮溶液50μl以及三乙胺溶液50μl，通过添加300μl丙酮，要盖紧螺旋盖，对其震荡处理1min，将其放在95℃的干燥箱中进行反应，15min之后取出之后将其冷却；然后添加75μl的醋酸丙酮溶液，将其震荡1 min之后，将其放在95℃中进行干燥箱反应处理5 min，然后将其冷却处理，通过氮气吹干处理，通过0.5ml的甲醇复溶将其进行微孔滤膜处理，放置1.5ml的上机小瓶中进行处理。

1.5 精密度试验

取0.25ml的血清进行精密量处理，根据规范要求进行五次处理，计算分析脂肪酸的浓度，并且计算相对标准偏差。

1.6 加样回收率试验

取0.25ml血清添加100μl对照品的工作融合，将其混匀之后，根据以上方法进行三次处理，获得标准曲线，计算各脂肪酸浓度，计算回收率。

2 奶牛血清中脂肪酸浓度测定结果

2.1 色谱图

8种脂肪酸混合标准品均达到了基线分离。奶牛血清样品色谱图中可以发现在25min以及32min的时候存在未定义峰，通过推测分析其可能是正-十二烷酸以及亚麻酸。并未检测到达奶牛血清的二十二碳六烯酸。

2.2 标准曲线

根据内标法计算分析脂肪酸标准曲线，分析对照品与内标物浓度比值、峰面积比值可以发现二者在线性范围中的相关系数均高于0.999。根据标准曲线计算分析脂肪酸最小定量限为0.01～0.22mg/L；其最小检测限为0.03～0.67mg/L。

2.3 精密度与回收率

分析精密度以及加样回收率，通过分析发现在实验中尚未检测出C22∶6。而C20∶5的 浓度则小于线性范围，通过增加取样量或者降低 C20∶5 的方式进行分析，提升检测精准性。其精密度RSD≤2.96%，而回收率则主要在 96～99% 区间范围中，此种方式精准、稳定。

3 讨论分析

3.1 衍生化方法

通过紫外线检测器进行脂肪酸的衍生化反应检测分析。通过2-溴苯乙酮作为主要的衍生化试剂，此种方式操作简单便捷，其产物相对较为稳定。在60min中则可以完全出峰。在处理中乙腈、丙酮以及正己烷都是性能良好的衍生化反应介质，而水分则就会降低反应得率，在此次实验中通过干燥箱加热的方式进行衍生化反应处理。

Wood 等学者明确的指出了如果2-溴苯乙酮过量则就会导致其与色谱柱中的填料产生作用。一些在其他任何富集在柱之上的带羧基化合物都会产生反应，这样就会对色谱峰检测产生一定干扰处理，为了提升检测的精准度。在衍生化处理之后要通过添加醋酸的方式进行衍生计处理，这也是影响试验结果的重要参数。

3.2 检测波长

通过SPD-16检测器进行光谱扫描功能处理，实现对脂肪酸衍生化产业的光谱扫描，确定其最大的吸收波长委托243.7mm，因此要通过244mm作为检测的波长。

4 结语

通过0HPLC 方法进行奶牛血清中脂肪酸浓度测定分析，其精密度较高，可以满足回收率的质量控制标准要求，可以为奶牛血清中脂肪酸含量检测提供支持。为奶牛脂肪酸紊乱的控制与检测提供了技术支持。