蜜蜂肠道微生物研究概况

黄祚骅，范季尧，吴珍红

(1.福建农林大学蜂学院，福建 福州 350017；2.福建农林大学林学院，福建 福州 350017)

约35亿年前微生物这一古老的生命就出现在地球上每个角落，与地球各种生态位紧密结合，参与地球养分循环，与人、动物和植物健康和疾病息息相关[1]。但目前99%的微生物尚未被发现与鉴定[2]。微生物成为全球研究的热点，美国、日本、加拿大、中国等都花费巨资设立微生物组研究计划，中国微生物组计划列入了“十三五”优先发展领域。在人类生活中，蜜蜂能产生极高的经济价值，它是存在于大自然中最重要的传粉昆虫类，它一方面可以提供宝贵的蜂产品，另一方面它对探究植物的多种形态和如何平衡自然界生态起着举足若轻的作用[3]。但相比于人和动物，蜂肠道菌群的研究较少。本综述主要从蜜蜂主要共生菌类群、共生菌在不同生境的肠道菌群分布、健康蜜蜂肠道中的病原微生物3个方面对近年来蜜蜂肠道菌群的研究进行总结，并对目前研究的一些问题进行了讨论。

1 蜜蜂主要共生菌类群

1.1 蜜蜂核心菌群

蜜蜂体内含有大量的微生物，如成蜂体内含有约109个细菌[4]，目前这些细菌的共生菌不但使蜜蜂对病虫灾害的抵抗性得以增强，同时增加了花粉物质被宿主消化吸收的能力，降低有毒物质、促进植物生长，甚至于蜜蜂种群的繁殖也被影响[5-8]。Cox-Foster等首次将美国、非洲、瑞士和德国等不同地区的同一种群的蜜蜂(Apismellifera)通过宏基因组进行比较分析，通过分析结果可以可以发现，其肠道内生菌的组成成分高度一致[9]。Gilliam他们为了将西方蜂类的肠道内生菌实行有关的剖离鉴别，通过测序结果我们可以知道西方蜜蜂的肠道微生物中有1%是酵母类微生物；29%为革兰氏阳性菌；革兰氏阴性菌，也有可能是可以更变的革兰氏细菌所承的占比为70%[10]。与此同时，Rada等人对蜜蜂的中肠和直肠的微生物也进行了研究鉴定，通过研究结果我们发现蜜蜂肠道内的菌落组成主要有厌氧、好氧菌、葡萄球菌、芽胞杆菌和酵母菌等，而其中好氧微生物的数量明显低于厌氧微生物，厌氧微生物的总数与厌氧革兰酸杆菌的数量基本一致[11]。在16S rDNA 序列结论和宏基因组的基础上，进一步对处在不同地方的西方蜜蜂的肠道共生菌进行研究，这一研讨的成果是发掘出这些生物体内的细菌可能为以下8种，分别是Gilliamella、Snodgrassella、Gammaproteobacteria、Bartonella、Acetobacteraceae、Bifidobacterium、Lactobacillus、Lactobacillusacidophilus[9，12-14]。

以上可知，因分类采用的研究方法不同造成分类名称的差异，有待于规范。虽然在生活环境、地理位置和蜂类种群的影响，但细菌的肠道共生菌却未因此受到太大的影响，属高度保守的状态[12]。Martinson等人发现蜜蜂肠道中的内生菌中其它细菌与核心菌相比数量稀少并且呈现不稳定性分布，不过我们可以确定蜜蜂的肠道中有严格的生态位。熊蜂以及蜜蜂属的其他种类蜂都具有与西方蜜蜂相同的核心菌群[15]。在蜂群中，蜜蜂肠道的共生菌的菌落与菌种之间的交流紧密相连，因而在一定程度上也提高了蜂肠内共生细菌与蜜蜂的进化能力。在对处于不同地方的蜜蜂进行分析的时候发现并没有很强的相关性，那么蜜蜂肠道中的共生菌不存在地域差别的原因可能与蜜蜂在不同季节会到各地进行授粉导致不同地域的蜜蜂之间不存在长时间地理隔离的原因。

1.2 不同蜜蜂菌群差异以及蜜蜂真菌分离

美国耶鲁大学的Moran分别在两个不同的地方各4种不一样的蜜蜂群落里收集了40只蜜蜂，通过454测序平台对蜜蜂肠道共生菌进行16 S rDNA V6-V8可变区序列扩增产物进行深度测序研究，对意大利蜜蜂肠道内生菌与地域、种群之间的关系进行了分析，以此来探讨蜜蜂共生群的差异性[16]。Gilliam等人对生长在意大利的工蜂肠道共生菌进行分离鉴定，其结果显示了Enterobactercloacae、Escherichiacoli、Enterobaceraerogenes、shigelta、Klebsiella等5种菌株，并未从蜂类的肠道中分离出假单胞菌和欧文氏菌属，同时也分离出了Alternariatenuissima、Cladosporiumcladosporioides、Bipolaris、Curvularia、Penicilliumochrochloron、Penicilliumurticae和Rhizopusarrizus这7种真菌，并且还分离出7种酵母菌，其中Torulopsismagnoliae、Candidaparapsilosis、Torulopsissp．分离率最高[17]。蜜蜂肠道共生菌会缺失一部分的核心菌种，并获得的某些新菌种，这一过程受到宿主的进化的影响。比如大蜜蜂(Apisdorsata)的肠道中并没有Snodgrassella的存在，但是在蜜蜂属中，全部的蜂种都是拥有新的Bartonella、Frischella属细菌，而在熊蜂属及无刺蜂肠道中并没有发现，表明了这是在蜜蜂书蜕变进化中所获得的这一分支。

2 共生菌在不同生境的肠道菌群分布

2.1 不同蜂龄的肠道菌群分布有差异

蜜蜂肠道共生菌也受蜜蜂蜂龄的影响。将中华蜜蜂的发育阶段采用16S rDNA V6-V8更正变化区进行PCR-DGGE分析。其中对封盖一日龄蛹、破巢幼蜂和采集蜂这3个龄期分别开始着重研究，结果表明采集蜂肠道内的微生物种类最丰富，而其它2个龄期的肠道微生物很相似，通过对结果进行测序，获得了Gilliamella、Snodgrassella、Carnobacterium、Nesseriaceae、Frischella、Janthinobacterium、Pseudomonas、Lactobacillus、Lactococcus和Leuconostoc10种菌属。他们当中的封盖一日龄蛹和破巢幼蜂的主要菌属为SnodgrasseUa和Pseudomonas；采集蜂的主要菌属为Giuiamella和Snodgrassella。Moran对意大利多个地方的蜂群进行观察，发现成年蜂肠道内的共生菌主要为Snosgrassella等菌群[16]。杨志波他们对夏秋季交替时候的意大利工蜂肠道中分别鉴别出Bacillus、Proteus、Citrobacter、泛生菌属Pantoea、Enterobacter、Klebsiella和假单胞菌属Pseudomonas[18]。可以运用qPCR和454渗透测序的方式对蜂种所有的发育阶段(幼虫，新出房的蜜蜂以及成年蜜蜂)的不同时问段的蜜蜂肠道共生菌的分布情况和定值程度进行研究是Martinson等人的成果，这一结果证明了幼蜂和工蜂肠道内繁养的菌类是微少的，不过在有年纪差异的成年工蜂中，它的肠道内生菌的成分也明显不同[4]。

2.2 蜂道不同部位的肠道菌群分布有差异

肠道微生物也受蜂道位置的影响。利用微传感器对蜜蜂肠道的前、中、后3个位置的酸碱度进行测量，结果显示这3个位置的酸碱度有显著差异(蜜蜂前肠、中肠、后肠的酸碱度大概为8、10、7)，后肠微生物数量最多，这是一个导致肠道微生物分布不均匀的重要因素[19]。Martinson等利用qPCR等方法，对蜜蜂的肠道的不同位置进行了观察，利用高通量测序来测定肠道共生菌的数量以及它们的分布关系，证明了蜜蜂肠道微生物受肠道不同位置的影响[4]。蜜蜂后肠具有丰富的肠道微生物，共生菌个数大概为109个，高达占比属于细菌量的99%。蜜蜂拥有回肠和直肠2个独立区域，每一个区域都拥有相应的独特菌种。蜜蜂的回肠中的两种革兰氏阴性菌为优势菌种[4，20]。而在蜜蜂的直肠中，革兰氏阳性菌乳杆菌Lactobacillus、Lactobacillusacidophilus和Bifidobacterium为优势菌种但是这两种乳酸菌在回肠的肠腔中被发现过，不一样的是只有稀少的含量。蜜蜂的幽门、蜜囊的共生菌的优势菌种也不一样，其中蜜蜂幽门处的F.perrara含量丰富，而蜜囊种则是Lactobaeillus菌群占优势，并且与花蜜和蜂巢中大部分的共生菌的菌种同源性很高。沃尔巴克氏菌(Wolbachia)在全球的散布也是广泛的。它普遍存在于西方蜂蜜的生殖组织中，并且对蜜蜂的种群繁育具有重大的影响[10，21]。

2.3 蜂道季节、抗生素对肠道菌群分布有影响

蜜蜂的肠道共生菌的数量和种类受季节的影响。Rada等人通过对夏冬季的特定的蜜蜂总群的肠道微生物进行分离鉴定，确定一些典型的肠道菌群的种类。测序结果显示厌氧和好氧微生物、乳酸杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、芽胞杆菌和酵母菌是蜜蜂肠道微生物中的常见种群。冬天的蜜蜂肠道中有更多的厌氧微生物和酵母菌，夏天的蜜蜂肠道中则有更多的大肠杆菌和葡萄球菌[11]。

抗生素也是影响蜜蜂肠道共生群种类的一个重要因素。Gilliam等从388只蜜蜂的肠道中分离出18种真菌，对部分蜜蜂喂食土霉素和富马西林等抗生素，使之与原始对照组进行比较来观察真菌的存在情况。通过观察真菌变化可知，抗生素对蜜蜂肠道微生物的成分造成了影响，与原始对照组相比，喂食抗生素的蜜蜂所含的真菌种类明显变少[17]。抗生素可以丰富蜜蜂的耐药基因库，有益于宿主的微生物的群落改变，但是长时间的喂食单一抗生素很有可能是的蜜蜂蜂群中对抗生素出现抗药性。Tian等利用PCR和测序技术对美国不同地区的蜜蜂肠道细菌的抗生素抗性位点进行诊断，发现长期喂食盲目的喂食单一抗生素导致了蜜蜂肠道微生物群产生相应的抗性基因，而在不使用抗生素养蜂的地区，蜜蜂肠道的抗性基因明显要少很多。由此可以推断，美国某些区域的蜜蜂肠道共生菌的菌群失调是因为养蜂人使用新抗生素所造成的[22]。

3 健康蜜蜂肠道中的病原微生物

蜜蜂与其肠道内的病原微生物也有很大的联系，拟幼虫芽胞杆菌、蜂房球菌、尤瑞斯杆菌、粪链球菌、尘埃芽胞杆菌、蜂房哈夫尼菌等病原菌大量的生存在蜜蜂的肠道内。其中由拟幼虫芽胞杆菌和蜂房球菌导致的美欧蜜蜂的致命结果是蜜蜂幼虫大幅度腐烂死亡，对蜜蜂种群的繁衍造成毁灭性的影响，如果不加以控制，这两种疾病很可能对蜜蜂种群造成毁灭性的打击[23-24]，不过这些病原菌在一般情况下保持稳定，无法引发蜜蜂的某些病症，只会在特定情况下受部分外界条件的诱发才有几率导致该疾病的发生。最近几年，如蜂群崩溃症(colony collapse disorder，CCD )等蜂群类病症所导致蜜蜂数量聚减情形，使人类更加专注于蜜蜂健康的研究，同时也加大了对蜜蜂肠道中各式各样微生物肠道的钻研力度[25]。

4 讨论

综上所述，现在的研究体现出了蜜蜂肠道拥有一个简单的核心菌群。在单个蜜蜂个体肠道中，菌株的种类非常丰富。不过根据时间的推移，现代更加先进的技术对肠道菌的研讨结果势必与传统的方式方法带来的结果有所不同，这样的结果使得社会对于共生菌菌属的说明不统一，在学术界关于肠道共生菌相关的理论有所冲突；另一方面，共生菌在各个蜂群种类中稳定繁殖与交错更替所产生的变化道理仍是模糊不清的状态。怎么样去处置这样的问题是未来研究的重要之处。目前人类所掌握的各种技术不断在进步与发展，传统意义上的培养方式已经显得容错率不高，我们可以知道的是，使用16S rRN A分析等分子生物学方法可以在现阶段帮助我们去研究这一问题，这种方式是基于高通量测序的宏基因组分析，在不同种类，不同样式的蜂间中进行比选，以此来推动在蜜蜂肠道菌群中不断发现，研究其特殊功能与演化历史、研究共生菌对蜂群健康、开发含益生菌制剂的蜂粮、进行蜂的生物防治等，这项研究在今后将会对中国蜜蜂的研究及我国生态、经济、农业等的维护与发展产生不可磨灭的重要意义。