昆虫中肠Cry受体蛋白及其功能分析

万 艺，方 妍

(福建农林大学林学院，福建 福州 350002)

Bt Cry毒素与昆虫中肠BBMV上的分子特异性结合是决定Cry毒素宿主范围的重要因素。在结合试验中，利用BBMV以及被标记的Cry毒素阐明了Cry毒素与昆虫幼虫中肠相互作用的特征。在过去的20年中，Bt研究者面临的主要挑战是识别与Cry毒素特异性结合的分子，并且推断出该分子与Cry毒素功能的相关性。

1 钙粘蛋白

钙粘蛋白被普遍认为是一种功能性的Cry蛋白受体，其与Cry毒素结合主要定位于中肠细胞的刷状边缘膜囊泡[1]。钙粘蛋白也被发现锚定于烟草角虫(Manducasexta)和舞毒蛾(Lymantriadispar)中肠上皮细胞底膜中[2]。一种名为BT-R1(Bt受体1)的钙粘蛋白首次在烟草角虫幼虫中被鉴定为Cry毒素受体，研究表明，Cry1A毒素与Bt-R1具有高亲和力，且在体外培养的昆虫细胞中表达的Bt-R1对Cry1A毒素具有敏感性。钙粘蛋白作为Cry1A毒素受体，其相关功能已经在欧洲玉米螟(O.nubilalis)和烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)等昆虫中被证实。与Cry1A蛋白耐药性相关的钙粘蛋白突变在许多昆虫中都有相关记录，包括粉色棉铃虫、棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)、烟芽夜蛾。从甜菜夜蛾(Spodpteraexigua)中获得部分钙粘蛋白基因，克隆了钙粘蛋白基因(SeCad1)的全开放阅读框，通过RNA干扰甜菜夜蛾钙粘蛋白的表达，揭示出钙粘蛋白是Cry1Ca毒素的特异性靶分子，也说明钙粘蛋白不仅为鳞翅目幼虫Cry1A类毒素受体[3]。

鞘翅目昆虫钙粘蛋白也是Cry3Aa以及Cry3Bb毒素的功能受体。相关研究从黄粉虫(Tenebriomolitor)幼虫中肠mRNA中克隆了Cry3Aa受体钙粘蛋白，并且预测蛋白TmCad1具有与鳞翅目钙粘蛋白相似的结构域和假定的毒素结合区。研究发现TmCad1蛋白假定毒素结合区的肽段能与Cry3Aa毒素特异性结合并促进Cry3Aa毒素低聚物的形成[4]。有研究从小粉虫(Alphitobiusdiaperinus)幼虫体内发现一个185kDa钙粘蛋白(AdCad1)，其具有钙粘蛋白的典型结构成分，包括9个胞外重复序列(CR9)、一个近膜端胞外域(MPED)和一个胞质区域。CR9和MPED区域的肽段能够与Cry3Bb毒素高效结合，并显著协同Cry3Bb毒素对抗小粉虫幼虫。进一步研究发现，通过RNAi使得AdCad1基因沉默，导致了双子叶植物幼虫对Cry3Bb的敏感性显著降低，这些结果证明AdCad1是Cry3Bb毒素的功能性受体[5]。

在双翅目昆虫中，钙粘蛋白被认为是埃及伊蚊(Aedesaegypti)Cry11Aa与Cry11Ba毒素以及冈比亚疟蚊(Anophelesgambiae)的Cry11Ba毒素的功能受体。尽管Cry4Ba毒素能与埃及伊蚊以及冈比亚疟蚊的钙粘蛋白结合，但相比与Cry11结合，Cry4Ba毒素的亲和力更低，这解释了埃及伊蚊幼虫中RNA干扰钙粘蛋白表达后，增加了幼虫对Cry11Aa的耐受性，但对Cry4Ba的毒性没有产生影响[6]。

2 氨肽酶

氨肽酶N(APN)为锌化金属蛋白酶超家族中的亚科。其通过GPI锚定在中肠刷状缘膜囊泡，并从N端降解多肽序列，这是氨基酸共转运进入上皮细胞的必要环节。大量鳞翅目昆虫的氨肽酶N(APN)可以与天然Cry毒素结合。对鳞翅目APN类氨基酸序列进行系统发育分析，将其分为7个家族，发现在已有表达数据的APN家族中，APN1家族基因在中肠组织中表达最高[7]。已知，Cry1毒素与中肠APNs之间的相互作用涉及对初级蛋白结构位点的识别，研究发现Cry蛋白和APN的互作与糖基化位点具有关系，在烟草夜蛾(Heliothisvirescens)和舞毒蛾(Lymantriadispar)中的N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)的氨肽酶N区域是CrylAc蛋白结合部位。Cry1Ac与烟草角虫以及舞毒蛾的APNs结合具有糖依赖和非糖依赖部分，相关模型表明，凝集素结构域III通过识别舞毒蛾APN上的GalNAc启动对接，在初级对接之后，发生更高的亲和结构域II结合机制，这对于杀虫活性至关重要，Cry1Ac毒素还以不同于半乳糖作用方式识别了烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)中的APN[8]。斜纹夜蛾(Spodopteralitura)APN作为Cry1C结构域II的loop 2和loop 3识别位点[9]。

在20世纪90年代，APN被证实为Cry1受体，因为APN制剂能够增强Cry1诱导的细胞膜囊泡和膜双层离子通道的形成。后续研究，转基因果蝇中表达了烟草角虫APN，使Cry1Ac对于果蝇幼虫具有显著的杀虫活性，提供了Cry受体蛋白的体内实验证据。由RNA干扰(RNAi)引起的斜纹夜蛾，小蔗螟(Diatraeasaccharalis)以及烟芽夜蛾中肠APNs基因沉默，证实了它们分别为Cry1C，Cry1Ab,以及Cry1Ac毒素的受体。另外，特异性APN的突变或表达下降与小蔗螟，烟草角虫以及烟芽夜蛾对Cry1毒素的抗性有关。粉纹夜蛾(Trichoplusiani)对Cry1Ac抗性与两个APN的差异变化有关;抗性幼虫中APN1表达显著下调，APN6表达显著上调。此外，在耐药幼虫中缺乏APN1蛋白与转录水平降低有关[10]。

APNs在Cry毒素灭蚊中的作用已引起广泛关注。相关研究表明感染黄热病的埃及伊蚊的Cry11Aa及Cry11Ba受体，以及感染疟疾的冈比亚疟蚊的Cry11Ba受体存在差异。A.aegypti和Anopheles中特异性APNs分别与Cry11Aa蛋白以及Cry11Ba蛋白结合，并且具有高亲和力。有趣的是，在生物测定中，部分APN片段的存在提高了Cry幼虫的死亡率[11]。一个来自功能受体的意外发现表明APN和毒素之间的相互作用是可逆的。RNAi引起的埃及伊蚊APN基因沉默导致其对Cry4Ba毒素的耐受性增强，证明APN为该毒素的的功能受体。

3 碱性磷酸酶

在鳞翅目、鞘翅目以及双翅目的昆虫幼虫发现碱性磷酸酶(ALP)为Cry毒素结合的功能性受体。在含有Cry1Ac时，烟芽夜蛾和烟草角虫幼虫中肠蛋白的ALP酶活性降低，证实Cry1Ac与ALP之间存在互作。利用蛋白质组学分析检测到Cry蛋白与来自烟草角虫，烟芽夜蛾以及埃及伊蚊刷状缘膜囊泡(BBMVs)上的ALPs进行结合。结果与APN的情况相似，Cry1Ac与ALP的结合涉及到与GalNAc的相互作用。对于Cry1Ab，其与ALP最开始通过结构域III的β-16区域相互作用，这一步对于与ALP结合以及对幼虫的毒性是极其关键的。由RNAi引起的烟草角虫幼虫中APN和ALP基因沉默表明，与APN相比，与ALP结合对Cry1Ab的毒性更重要，而Cry1Ac更依赖APN[12]。在烟芽夜蛾，棉铃虫中ALP表达降低与对Cry1毒素的耐药性之间的相关性进一步证实了在鳞翅目幼虫体内的ALP与Cry毒素的作用。在双翅目昆虫中，A.aegypti和AnophelesBBMV上的ALP能够与Cry11Aa毒素以及Cry11Ba毒素相互作用是其在体内发挥毒性的关键步骤。此外，利用RNAi对埃及伊蚊ALP1基因沉默，确定其为Cry11Aa毒素以及Cry4Ba毒素的功能受体[13]。

4 ABC转运蛋白

昆虫ABC蛋白家族与动物体内的多药耐药蛋白有关。节肢动物ABC基因家族的比较基因组学以及ABC蛋白在外源生物和杀虫剂中的转运关系已被详细介绍[14]。ABCC2突变及其对Cry1A毒素的抗性之间的基因连锁表明了ABCC2蛋白对Cry1毒素的作用模式。将耐药位点分离到不同的菌株中，可以证明在烟芽夜蛾菌株中，钙粘蛋白突变与缺乏Cry1Aa的结合有关，而ABCC2基因的失活突变与缺乏Cry1Ab和Cry1Ac结合有关。小菜蛾和粉蚊夜蛾的ABCC2相关位点的突变也会引起其对Cry1Ac产生抗性，为该蛋白在Cry1A毒素作用中的功能提供进一步的支持。通过对家蚕(Bombyxmori)的研究，直接证实了ABC转运体对Cry1A毒素作用的重要性，在研究中，将ABCC2蛋白外腔表面loop结构插入一个酪氨酸使易感家蚕对Cry1Ab产生抗性[15]。此外，通过比较野生型和突变型ABCC2基因在昆虫细胞中的表达，证明了酪氨酸的插入和ABCC2蛋白对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa甚至相对不相关的Cry8Ca易感性起重要作用[16]。尽管这些研究阐明了ABCC2蛋白在Cry毒素作用中的关键作用，但目前还没有实验验证ABCC2与Cry毒素相互作用的机制。

5 其他Cry受体蛋白和分子

除上述受体外，还有其他物质被研究报道为Cry毒素的结合分子和假定受体，包括烟草角虫的糖脂，舞毒蛾的糖结合物，聚钙蛋白家族成员，马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)的一种ADAM金属蛋白酶，赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)钠溶质转运体，冈比亚疟蚊的淀粉酶和α-葡萄糖苷酶。油脂和Cry毒素相互作用最早在研究红头丽蝇(Calliphoravicina)蛹中提取的糖脂与Cry1A原核蛋白和与活性毒素的结合中发现。虽然发现了与糖脂结合的毒素，但这一证据没有被广泛考虑，可能是因为苍蝇幼虫通常不容易受到Cry1A毒素的影响。糖脂作为Cry毒素受体的功能证据来自于新秀丽小杆线虫(Caenorhabditiselegans)对Cry5Ba的抗性研究，该研究也证实了从烟草角虫中肠组织中提取的Cry1A毒素与糖脂特异性结合，即证明了Cry中毒中脂质的作用[17]。糖脂与Cry毒素结构域II相互作用形成Cry毒素低聚物的作用机制以被证实，然而，脂质与Cry毒素相互作用与毒性的关系尚未得到实验证实。

研究发现了一个252 kDa的聚钙蛋白家族成员能够与Cry1A毒素结合并形成复合物，这种蛋白质以低聚物的形式存在于昆虫体内，但它不干扰桑蚕幼虫的活动。Cry毒素和多钙蛋白家族成员之间的相互作用也有报道。综上所述，Cry毒素与中肠液中的脂质或蛋白质之间相互作用对随后与中肠细胞受体结合具有十分重要的作用。

多种蛋白已经被报道参与了L.decemlineata中Cry3A的毒性反应，在这个系统中，BBMV蛋白对Cry3Aa的蛋白水解可以减少膜穿孔。然而，Cry3Aa结构域II的loop 1与ADAM金属蛋白酶的交互作用对毒素孔的形成具有重要作用[18]。此外，有研究利用蛋白组学以及结合Western blot杂交的方式，在烟芽夜蛾中发现能够与Cry1Ac毒素结合的受体为V-ATP合成酶亚基A(V-ATP synthase subunit A)与肌动蛋白[19]。

最近的研究发现棉铃虫(Helicoverpaarmigera)中具有特殊的四聚氰胺基因位点突变，导致H.armigera对Cry1Ac蛋白产生显著的抗性，而Cry1Ac是中国种植的转基因棉花生产的唯一一种Bt蛋白。因此，为了加强耐药性管理，对四聚氰胺突变位点进行主动识别和跟踪，基因组分析、基因编辑和分子监测是十分必要的[20]。

6 展望

昆虫对苏云金杆菌产生抗性是Bt应用于农林业害虫防治的限制因素。在Bt毒素发挥杀虫过程中与受体的互作是关键步骤，由于受体发生突变导致昆虫对Cry毒素产生一定抗性，抗性机制主要是毒素与昆虫BBMV上的受体蛋白结合能力的降低有关。明确不同Cry毒素与受体之间的作用机制有利于研发高效的Bt作物和Bt生物农药制剂，使得化学农药的使用量减少，有利于保持健康的生态环境，为我国农林业害虫的生物防治提供一种新的思路。