环状RNA 在皮肤相关疾病中的研究进展

张琛 戴钰 周美娟

南方医科大学公共卫生与热带医学学院放射医学系（广州510080）

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种在真核和原核细胞中广泛表达的以共价闭环结构为特征的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA），因缺乏5′和3′游离末端故不易被核酸外切酶R（Ribonuclease R，RNasa R）降解；此外，多数circRNA 在不同物种间具有高度的保守性。1979年，HSU 首次在真核细胞中证实circRNA 的存在［1］，但circRNA 最近几年才从RNA 数据库中被重新发掘出来。

circRNA 是一大类有调节功能的ncRNA，包括三种类型：外显子环状RNA（exonic circRNA，ecircRNA）、外显子-内含子环状RNA（exonic-intronic circRNA，EIcircRNA）以及内含子环状RNA（circular intronic RNA，ciRNA）。真核细胞中circRNA 主要由前体mRNA 反向剪接形成，其形成主要通过四条途径：（1）剪接体依赖性环化；（2）内含子配对驱动环化；（3）套索驱动环化；（4）蛋白因子相关性环化［2］。circRNA 主要发挥以下功能：作为miRNA 海绵、转录后调控、编码蛋白质、产生circRNA 衍生的假基因以及影响可变剪切。circRNA 在皮肤相关疾病中主要是行使miRNA 海绵的作用，如：黑色素瘤中增加的hsa_circ_0084043 通过海绵吸附miR_153_3p 来促进Snail 的表达从而增加其恶性程度［3］；皮肤创伤中增加的circ_Amotl1 海绵吸附miR_17_5p 导致其靶基因Stat3、Dnmt3a 以及fibronectin 的表达增加从而加速创伤愈合［4］；亚砷酸盐处理的人永生化表皮细胞中增加的hsa_circ_100284 作为hsa_miR_217海绵，上调miR_217 的靶基因EZH2 的水平导致细胞周期加速并引起恶变［5］，降低的hsa_circ_008913 通过海绵吸附hsa_miR_889 从而间接下调其靶基因DAB2IP，导致ZEB1 表达增加引起HaCaT 干细胞样功能获取从而引起恶变［6］等。

1 circRNA 在皮肤相关疾病中的作用

circRNA 在机体代谢及疾病发展中发挥重要作用，比如衰老、胰岛素分泌、组织生长、动脉粥样硬化，高血压以及肺癌等［7］。越来越多的证据表明circRNA 在皮肤相关疾病的发生发展中发挥了重要的作用。

1.1 circRNA 和皮肤肿瘤

1.1.1 circRNA 和皮肤鳞癌 皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是一种恶性的皮肤上皮肿瘤，约20%的病例会发生转移，其五年生存率约为25%～50%。研究表明：circRNA 和miRNA 参与cSCC 发生和转移的分子病理学机制中。SAND 等［8］通过基因微阵列研究发现，在皮肤鳞癌中，共有322 种circRNAs 差异表达（143 种表达上调，179 种下调）。其中上调最明显的两种circRNAs分别是hsa_circ_0070933 和hsa_circ_0070934，均由La 核糖核蛋白域家族成员1B（LARP1B）剪切形成，La 核糖核蛋白域家族成员1（LARP1）与3000 种癌症通路的mRNA 结合促进癌症进程［9］。其他上调的circRNAs，比如hsa_circ_0032704，由微管蛋白酪氨酸连接酶样家族成员5（TTLL5）剪切形成，TTLL5 为子宫内膜癌中的肿瘤抑制子，可以减缓卵巢癌细胞系的生长；hsa_circ_0009065 是由双官能凋亡调节子（BFAR）剪切形成，已经证实BFAR 在结直肠癌组织中显著高表达；hsa_circ_0074817 由与恶性血液疾病相关的早B 细胞因子1（EBF1）剪切形成。在下调的circRNAs 中，下调最明显的hsa_circ_0022392 和hsa_circ_0022383 都是由脂肪酸去饱和酶2（FADS2）剪切形成，FADS2 位于热点癌基因11q13 上，并且已被证明在乳腺癌中高表达［8］。目前关于皮肤鳞癌中circRNA 的研究仅此一篇且仅限于基因微阵列层面，circRNA 在cSCC 中究竟发挥何种作用还需进一步研究证实。

1.1.2 恶性黑色素瘤 恶性黑色素瘤是一种起源于生黑色素细胞的癌症，是导致皮肤癌症相关性死亡的主要原因之一。LUAN 等［3］通过circRNA 微阵列技术分析了33 例恶性黑色素瘤组织和人表皮黑色素细胞中circRNA 的表达情况，发现hsa_circ_0084043 在黑色素瘤组织以及人黑色素瘤细胞系（A375、SK_MEL_1、SK_MEL_5 以及A875）中呈现高表达。hsa_circ_0084043 和黑色素瘤临床分期显著相关，但和年龄、性别、家族史以及溃疡无关。作为黑色素瘤的独立危险因素之一，hsa_circ _0084043 高表达组生存率更低。在分析circRNA_0084043 功能的研究中，发现在临床样本中hsa_circ_0084043 和Snail mRNA 水平呈正相关。在A375 和A875 细胞中，通过沉默或过表达hsa_circ_0084043，证实其在黑色素瘤中是通过海绵吸附miR_153_3p 来促进Snail 的表达。同时采用CCK-8 实验、划痕实验以及侵袭迁移小室实验证明下调hsa_circ_0084043 的表达能显著地抑制黑色素瘤细胞的增殖、侵袭能力以及裸鼠皮下成瘤的能力。这些结果表明circRNA_0084043 在体内外增加了黑色素瘤的恶性程度。

HANNIFORD 等［10］对黑素细胞和黑素瘤细胞系RNAseq数据的分析提示黑素瘤细胞中circRNA_CDR1as表达缺失，RT-qPCR 证实黑素瘤细胞系和组织中circRNA_CDR1as低表达。统计学分析显示circRNA_CDR1as 表达的缺失与黑色素瘤转移以及较差的预后相关。他们用黑素瘤细胞系证实：CDR1as 的缺失增强了黑色素瘤细胞的体外侵袭能力和体内肺转移能力。在circRNA_CDR1as 下游基因的研究方面，circRNA_CDR1as 缺失在黑色素瘤里面不是通过miR_7 发挥作用，而是通过降低参与氧化磷酸化（OXPHOS）和线粒体功能的蛋白质的表达来实现的，这些结果表明circRNA_CDR1as 缺失可能是通过改变黑素瘤细胞的代谢来发挥生物学功能。

1.1.3 基底细胞癌 基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）是来源于皮肤或附件基底细胞的一种中度恶性肿瘤，进展缓慢，呈局部浸润生长。SAND 等［11］通过circRNA 微阵列分析发现在基底细胞癌中有23 种circRNAs显著上调，48 种circRNAs 显著下调。发现circRNA 和MREs的配对如下：hsa_circ_0022392/hsa_circ_0005085 和hsa_miR_93、hsa_circ_0004777 和hsa_miR_301、hsa_circ_0008732 和hsa_miR_19b_1、hsa_circ_0005912 和hsa _miR_196、hsa_circ_0022392 和hsa_miR_181a_2（hsa_miR_181c/hsa_miR_181d）、hsa_circ_0008732 和hsa_miR_130b、hsa_circ_0005085和hsa_miR_106b、hsa_circ_0086419和hsa_miR_100、hsa_circ_0015449 和hsa_miR _145 、hsa_circ_0075828和hsa_miR_1224 以及hsa_circ_0086419 和hsa_miR_3196。上述差异表达的circRNAs 的线性转录本在多种癌症中被证实具有相应的生物学功能，例如上调处于第三位的circRNA— hsa_circ_0008732 和hsa_circ_0086419 由锌指蛋白BNC2 剪切形成，BNC2 是卵巢上皮癌的易感基因，与多形性恶性角质细胞瘤以及食管上皮细胞肿瘤显著相关，也是介导持续性皮肤着色的候选基因［12］。Hsa_circ_0001370 由YEATS2 基因编码，YEATS2 在软骨肉瘤中表达异常［13］。hsa_circ_0005795 由LPXN 基因剪切形成，LPXN 编码前列腺癌细胞中属于盘尼西林蛋白家族的一种黏着斑蛋白，有报道证实这种黏着斑蛋白在前列腺癌的一个亚型中表达升高。转录调节因子基因SOX13 剪切出hsa_circ_0004777，在少突神经胶质瘤中表达上调［14］。hsa_circ_0080189 由TNS3 剪切形成，TNS3 是一种和多种恶性肿瘤相关的肿瘤蛋白，高分化肺癌、多囊性间皮瘤、乳腺癌、肾透明细胞癌以及黑色素瘤等的发生发展都与其相关［15］。两个下调最明显的circRNA—hsa_circ_0022383和hsa_circ_0022392，均由FADS2 剪切而来，已有报道显示FADS2在胰腺癌中差异表达［16］。hsa_circ_0005085是由ArfGAP 的SH3区的ASAP2编码，ASAP2在肾透明细胞癌中表达下调［17］。hsa_circ_ 0072386、hsa_circ_0072387、hsa_circ_0072389 以及hsa_circ_0088621 均由HMGCS1 剪切形成，四种circRNAs 在基底细胞癌中均表现为下调。有趣的是，有五种上调和三种下调的miRNAs 与上调前十位的circRNAs 的miRNA 结合位点一致，有四种上调和一种下调的miRNAs 与下调前十位的circRNAs 的miRANs 结合位点一致。其中多数miRNAs 来自miRNA 肿瘤基因簇—oncomiR_1簇（包含hsa_miR_17、hsa_miR_18a、hsa_miR_19a、hsa_miR_19b_1、hsa_miR_20a 以及hsa_miR_92），它们具有增强细胞增殖和抑制凋亡的功能［18］。OncomiR_1 簇家族成员在基底细胞癌中也是过表达的，有研究表明这些miRNAs 参与基底细胞癌的分子发病机制［19］。但是该研究结果为描述性的并且数据来源样本较少，还需要大样本量的深入的机制研究来探索circRNA 在基底细胞癌中所发挥的作用［11］。

1.2 circRNA 和自身免疫性皮肤病

1.2.1 circRNA 和银屑病 银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，病程较长，有易复发倾向，临床表现以红斑、鳞屑为主。银屑病可能的病因包括遗传因素、感染、免疫异常以及内分泌因素等，目前具体的发病机制尚未明确，T 细胞以及免疫活性分子介导的炎症反应可能在其中扮演重要的角色。QIAO 等［20］研究发现：在银屑病中共有4 956 种circRNAs 差异表达，其中3 016 种表达上调，1 940 种表达下调，并识别出4 405 种circRNAs 含有miRNA 反应元件，即推断它们可通过ceRNA 机制发挥调节miRNA 的作用。在所有差异表达的circRNA 中，hsa_circ_0061012 上调最显著，它包含的五种miRNAs 结合位点对应的miRNAs 分别是hsa_miR_7157_5p、hsa_miR_miR_4769_3p、hsa_miR_6817_5p、hsa_miR_4310 以及hsa_miR_6882_3p。用基因本体论分析（GO 分析）5 种miRNAs 的靶基因，最高的30 项富集分析结果多数是与银屑病相关的，如：T 细胞的分选，对白介素4（IL4）的反应，以及NF_κB 转运到核内的调节。说明hsa_circ_0061012 的异常表达可能参与到银屑病的发病机理中，然而详细的调节机制仍需要进一步的研究。

1.2.2 circRNA 和系统性红斑狼疮 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种多发于青年女性的累计多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织病，患病率约为0.2‰～1.5‰。研究表明遗传因素、内分泌、感染和环境因素均会促进SLE 的发展，但是具体发病机制尚未明确［21］。ZHANG 等［22］通过circRNA 微阵列的方式检测到SLE 病人血清中112 种circRNAs 是异常表达的，其中53 种上调，59 种下调，并在SLE 患者血浆和外周血单核细胞（PBMC）验证了hsa_circRNA_407176 和hsa_circRNA_001308 的表达下调。因此可见circRNA 对SLE 有潜在诊断价值。此外，此项研究还发现hsa_circRNA_001308 的表达与血浆中的CRP 和抗SSA 以及PBMC 中的白细胞减少相关；hsa_circRNA_406567 与血浆中的抗RNP 相关，表明hsa_circ_ 001308 和hsa_circ_406567 可能是预测SLE 中全身炎症或疾病严重程度的潜在生物标志物。LI 等［23］也对6 组SLE 患者和正常人血浆中circRNA 表达谱进行分析，发现207种circRNAs差异表达，其中113种上调，94种下调。从中挑选了8 种circRNAs 在另外24 组SLE 患者和正常人中来进一步验证，最终确认了4 种与微阵列结果一致的circRNAs：显著上调的为hsa_circ_102584、hsa_circ_400011、hsa_circ_101471，显著下调的为hsa_circ_100226。两个研究样本来源、样本量大小不同以及前者验证了circRNA 在PBMC 中的表达情况导致结果的差异。但是两者的研究仅是基于小样本的circRNA 微阵列的结果，更大样本量以及深入的机制研究亟待开展。

1.3 circRNA 和皮肤创伤愈合 YANG 等［4］近期研究发现circ_Amotl1 在小鼠皮肤切口模型中有加速创伤愈合的作用。异常表达的circ_Amotl1 增加了STAT3 和Dnmt3a 的蛋白表达水平，表达增加的Dnmt3a使miR_17的启动子区域甲基化，从而降低miR_17_5p 的水平，但其增加了纤连蛋白fibronectin 的表达。随后他们证实STAT3、Dnmt3a 以及fibronectin 均为miR_17_5p 的靶基因，降低miR_17_5p 会增加以上三者的表达进而导致细胞粘附、迁移、增殖、存活以及伤口修复能力的增加。关于皮肤损伤和circRNA 相互关系的文献报道目前非常少，笔者的研究主要关注UVB 所致的皮肤损伤，已筛选出部分差异表达的circRNA，目前正在开展相应的机制研究。

1.4 circRNA 和重金属导致的皮肤病变 砷是已知的致癌物质，致癌机制尚不明确。LIU 等［6］通分析亚砷酸盐处理的人永生化表皮细胞（T-HaCaT）中差异表达的circRNA并选取上调最为明显的hsa_circ_100284 来分析其对细胞周期的影响。最终研究表明，在HaCaT 细胞中，亚砷酸盐增加了hsa_circ_100284 的水平，hsa_circ_100284 作为hsa_miR_217 海绵，继而上调miR_217 的靶基因EZH2 的水平，EZH2 结合CCND1 的启动子区域，上调细胞周期蛋白D1 和CDK4，导致细胞周期加速并引起恶变［5］。随后他们又选取在T-HaCaT 中下调最为明显的hsa_circ_008913 进行研究。结果证实hsa_circ_008913 可作为hsa_miR_889 海绵，hsa_circ_008913 水平降低间接下调hsa_miR_889 的靶基因DAB2IP（一种Ras-GTP 酶激活蛋白，可以负向调控Ras 依赖的有丝分裂信号，在多种癌症类型中都是下调的［24］）的表达，上调ZEB1 的表达。功能学实验表明，过表达hsa_circ_008913 或者转染hsa_miR_889 抑制剂都降低了T-HaCaT 细胞的克隆形成、侵袭、迁移以及裸鼠成瘤的大小，并且这些效应可以被共转染hsa_miR_889 mimic 所反转。上述结果同样也表明hsa_circ_ 008913 作为miR_889的竞争性内源RNA（ceRNA）来发挥作用。他们同时发现在HaCaT 细胞中，亚砷酸盐引起皮肤干细胞表面标志物（k5 和CD34）mRNA 水平增加。研究表明miR_889 与癌干细胞（CSCs）的调节相关，它的主要功能是调节和细胞增殖相关的信号流并且可以阻断上皮间质转化（EMT）导致的转移；在人PCa 细胞中，DAB2IP 通过调节干细胞因子受体来调节癌干细胞表型［25］（癌干细胞是一个稀有亚群，拥有肿瘤发生以及自我更新的能力，维持肿瘤生长，与转移的形成相关；皮肤、乳腺、肝脏以及肺癌均由CSCs 引发）。因此，亚砷酸盐引起hsa_circ_008913 水平降低最终是通过增加皮肤干细胞表面标志物mRNA 水平，引起癌干细胞样功能获取进而导致恶性转化［6］。关于重金属离子导致皮肤病变的研究目前只涉及到细胞层次，更深入的研究有待进一步去开展。

2 circRNA 的临床应用与靶向治疗

circRNA 主要具有普遍、保守、特异、稳定以及表达水平高的特点，因此circRNA 作为诊断、疾病进程以及治疗后反应的生物标志物具有明显的优势。已有部分circRNA作为诊断标志物的例子，如食管癌中升高的circular RNA ITCH［26］，结直肠癌中多种降低的circRNAs［27］，胃癌中升高的circ_002059［28］等。但多数的疾病并没有发现特异circRNA 为其诊断标志物。此外，circRNA 在血浆以及其他体液中的循环尤其是在外泌体一类的微粒体中的代谢将是一个潜在的研究方向。

circRNA 也可能是一个潜在的治疗靶点。可以通过减少功能性转录本的环化或使用“mRNA 陷阱”在转录本中隔离功能失调的外显子从而达到降低circRNA 表达的效果。CiRS-7 是一个强力的miR-7 海绵，含有多种miRNA 反应元件可与miR-7 海绵结合，其可以瞬间结合或释放大量miR-7［29］，可见circRNA 具有强大的miRNA 海绵功能，因此可以通过人工构建对应的环状miRNA 海绵来抑制疾病相关miRNA 从而达到治疗疾病的目的［30］。

3 展望

综上所述，circRNAs在皮肤相关疾病以及损伤中发挥了重要的生物学功能，但在皮肤相关疾病的研究中，目前主要存在的问题是：（1）研究相对比较表浅，以观察到上调或下调的现象为主，对其机理的探讨相对较浅显。例如，circRNA_0048043 的上调可增加恶性黑色素瘤的恶性程度，circ_Amotl1上调可促进皮肤创伤愈合等，但这些circRNA 在诱导不同疾病发生发展中的详细机制还不明确，有待深入研究；（2）皮肤是个免疫器官，但目前有关circRNA和皮肤相关的疾病研究，主要集中在皮肤癌的相关领域，而对系统性红斑狼疮等皮肤重要的免疫性疾病的相关研究相对较少；（3）皮肤作为直接接触外界的组织器官，很容易受到复合损伤因素的作用，比如紫外线和PM2.5 的协同作用等，这也将是今后研究方向之一。circRNA 和其他ncRNA 相比更加稳定，因而其无论作为疾病的生物标志还是治疗的靶点都具有明显的优势，通过沉默促癌的circRNA 或其与肿瘤相关的位点可以达到靶向治疗的目的，临床应用前景广阔。