环状RNA 与冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系

李奇 杨俊 杨简 杨英

三峡大学心血管病研究所，三峡大学第一临床医学院心内科（湖北宜昌443003）

随着我国老龄化进程的推进，冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）的发病率逐年上升，已成为危害人类健康与生命的主要疾病之一，尤其是冠状动脉粥样斑块破裂所引起的急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），是死亡率居高不下的主要病因［1］。近年来，随着冠心病的研究不断深入，研究发现某些特殊非编码RNA 分子（Non-coding RNAs，ncRNAs）—环状RNA（circularRNAs，circRNAs）在冠心病的发展过程中出现异常表达并具有一定的调节功能，其作为生物标志物和治疗靶点在冠心病的诊断和治疗中发挥重要作用［2］。因此，本文就circRNAs的结构特点、生物学功能以及circRNAs在冠心病中的作用予以综述。

1 circRNA 的发现

早在40 多年前，研究者就已经在植物感染的病毒中发现circRNAs 的存在，然而，由于当时的技术条件限制，circRNAs 一度被认为是剪接过程中的异常产物或错误表达而被忽视［3-4］。直到2012年，DANAN 等［5］发现circRNAs 大量存在于古生菌中且具有一定的生物学功能。随后又陆续发现circRNAs 在人、斑马鱼、小鼠以及其他动植物中广泛存在，才使得circRNAs 逐渐被重视起来，成为ncRNAs 分子研究领域的新热点［6］。随着高通量测序以及芯片分析的发展，研究者在小鼠以及人类心脏组织中发现越来越多circRNAs 的表达，其中通过circRNAs 全基因组关联分析，在人类心脏组织中检测到的circRNAs 已超 过15 318 种［7-8］。circRNAs 在 心肌组织与血管中的大量表达为circRNAs 在冠心病中的研究提供了良好的基础。

2 circRNA 的结构与分类

circRNAs 主要通过蛋白质编码基因与RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase II ，Pol II）的转录合成，与典型线性RNA不同，circRNAs 不含有5’端帽子与3’端多聚A 尾结构，而是由前体RNA 以共价键首尾相连形成的闭合环状结构，因此不易被核糖核酸酶降解，而且与线性RNA 相比，其结构更加稳定［9-10］。迄今为止，研究人员发现的circRNAs 类型已高达10 万余种，并具有高度特异性、保守性且含量丰富可广泛存在于机体各个组织以及血液、唾液中［11-12］。关于circRNAs 的形成机制目前尚无定论，JECK 等［11］认为circRNAs 的生成可能存在两种模型：（1）套索驱动环化，由外显子跳跃介导跨域区域形成circRNAs 中间体，最终经套索剪接形成circRNAs 分子；（2）内含子配对驱动环化，由外显子两侧具有互补序列的内含子区域配对介导反向剪接从而形成circRNAs 分子。随后，ZHANG 等［13］提出第三种模型，即通过内含子互补序列（例如重复元件）的碱基配对使得插入的剪接位点连接紧密从而促进circRNAs 的产生。最新研究还发现RNA 结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）能够在间质-上皮转化过程中与前体mRNA 特点位点结合，从而促进circRNAs 的形成［12］。

基于来自亲本基因的外显子和内含子的组成成分，circRNAs 可以分为三类：外显子circRNA（exonic circRNAs，ecircRNA），其仅包含反向剪接的外显子；内含子circRNA（circular intronic RNAs，ciRNA），通 常 由 前 体mRNA 中释放所得；与外显子和内含子共同环化的外显子-内含子circRNAs（exon-intron circRNAs，EIciRNA）［11，14-15］。此外，前体tRNA也能够剪接成环形成tRNA内含子circRNAs（tRNA intronic circRNA，tricRNA）［16］。其中多数circRNAs来源于ecircRNA，但在生理与病理条件下，不同来源的circRNAs 在分子水平上以不同的作用方式发挥着重要生物学功能。

3 circRNA 的生物学功能

目前，已发现的circRNAs 的功能主要有四种类型：（1）miRNA 海绵作用，circRNAs 是一种竞争性内源性RNAs，含有共同的miRNA 反应元件，可以通过竞争性地与miRNA 结合导致miRNA 表达被抑制，由于circRNAs 具有单个或多个miRNA 结合位点，所以其可以像海绵一样吸收miRNA 降低其活性，从而间接调控miRNA 靶基因的表达［17-18］；（2）调控基因转录，存在于细胞核中ciRNAs 可以与polⅡ相互作用并以顺式作用方式调节宿主基因转录活性，同时含有来自其亲本基因内含子序列的EIciRNA，也可以与U1 小核核糖核蛋白相互作用，然后与其亲本基因启动子上的polⅡ结合从而增强基因的表达［15，19］；（3）调控转录与翻译，circRNAs 可以作为“基因陷阱”通过隔离转录起始点减少线性RNA 转录后的翻译，阻断终产物的表达，同时其还可以作为RBPs 的海绵，与RBPs 结合影响RNA 的转录从调节蛋白质表达水平［20-21］；（4）蛋白翻译作用，实现circRNAs 翻译作用的一种方式是通过其作为内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）的序列来促进起始因子或核糖体与可翻译的circRNAs 的直接结合［22］。因此，circRNAs 能够从调控基因转录、miRNA 海绵以及调控蛋白的翻译与表达等多种途径来发挥其生物学功能，并显示出对心血管疾病的重要调控作用，包括动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）、心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤等。

4 circRNA 与冠状动脉粥样硬化性心脏病

随着circRNAs 的更多功能被发现，研究证实circRNAs与神经系统疾病、心血管疾病以及肿瘤等多种疾病有关，而circRNAs 与冠心病之间的潜在关系也逐渐被揭示［2］。

4.1 circRNA 在冠心病中的诊断作用 circRNAs 具有高度特异性，在血管以及心脏组织中都存在表达，来自12 例人类心脏和25 例小鼠心脏标本中，研究人员分别发现了15 318 和3 017 种 在心肌中表达的circRNAs［7］。而在冠心病发展过程中，多种circRNAs 也出现表达失调，所以血清中circRNAs 表达水平的分析已成为冠心病诊断的新方法。ZHAO 等［23］通过芯片分析筛选出冠心病患者中共22 种出现差异性表达的circRNAs，其中12 种表达上调，10 种表达下调，并发现在这22 种表达失调的circRNAs 中，hsa_circ_0124644 在患者外周血中具有较高的敏感性与特异性，提示了hsa_circ_0124644 可能具有作为冠状动脉疾病的诊断标志物的潜在价值。另一方面，邹天宇等［24］在冠心病患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中检测发现，与对照组相比，冠心病患者PBMCs 中circTCF25 的表达显著下调，同时受试者工作特征曲线分析显示circTCF25 可能是冠心病诊断的潜在生物标志物，并证实circTCF25 的诊断价值明显高于心电图，约等于Holter 监测。除此之外，研究发现来自锌指蛋白609（zinc finger protein 609，ZNF609）基因的外显子1 形成的与AMI 相关的环状RNA（myocardial infarction associated circular RNA，MICRA）可能是AMI 后左心室功能障碍的预测因子［25］。VAUSORT 等［25］通过检测642 例AMI 患者外周血中的circRNAs 表达发现AMI 患者血液中的MICRA 水平明显低于健康人，而且MICRA 水平相对较低的AMI 患者其左心室功能障碍的风险更高，所以circRNAs 也可以作为MI的生物标记物对患者的预后进行有效预测。以上结果表明，circRNAs 在冠心病中的诊断价值不可小觑。

4.2 circRNA 在As 中的作用 As 是冠心病最常见要的血管病变，主要与脂质浸润、内皮损伤、血管平滑肌细胞迁移以及增殖密切相关。多个基因组关联分析发现，As的易感性与人类染色体9p21 上INK4/ARF 基因簇反义非编码RNA（antisense non- coding RNA in the INK4 locus，ANRIL）有关，而ANRIL 又可以自发剪接成环状形成环状ANRIL（circANRIL）［26］。HOLDT 等［27］研究发现circANRIL可以与60S 核糖体前体组装因子PES1 结合，抑制心肌细胞中核酸外切酶介导的加工和核糖体形成进而诱导核仁应激与抑癌基因P53 活化，最终促进凋亡的同时平滑肌细胞和巨噬细胞的增殖也被抑制，表明了circANRIL 可以防止As 的发生。LI 等［28］通过氧化修饰LDL（oxidative modified LDL，oxLDL）诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）损伤来建立As 体外模型，结果显示总共943个circRNA 存在异常表达，其中Hsa_circ_0003575 的表达显著上调，并发现抑制hsa_circ_0003575表达可以可以促进增殖，提高HUVECs 的血管生成能力以及减少凋亡的发生。在糖尿病患者中，高浓度的血糖可引起血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的异常增殖和迁移，加重As 的进程。CHEN 等［29］在体外实验中采用高糖诱导VSMCs 过度增殖和迁移也发现共983 种circRNAs 出现差异性表达，其中458 个表达上调，525 种表达下调，并确定了一种上调的circRNA-circWDR77，抑制其表达显著抑制VSMCs 的过度增殖和迁移，其机制可能是circWDR77 通过海绵作用靶向调控其下游靶点miRNA-124 和成纤维细胞生长因子2 来介导VSMCs 的增殖和迁移，从而影响As 的发展。

4.3 circRNA 在AMI 中的作用 AMI 作为冠心病中的急危重症，是导致患者死亡的主要危险因素，具有较高的病死率与致残率。研究表明，Cdr1as 作为circRNAs 家族成员也可以发挥miRNA-7a 海绵作用，降低miRNA-7a 的活性，而miRNA-7a 在心肌组织中可以通过抑制多聚ADP 核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）与转录因子SP1的表达来减少心肌细胞凋亡从而改善心肌损伤［30］。GENG等［31］在AMI 小鼠心肌或低氧处理的心肌细胞中发现，Cdr1as 与miRNA-7 的表达均上调并与心肌梗死面积成正比，同时，过表达Cdr1as 可促进过缺氧和AMI 损伤诱导的心肌细胞凋亡，这可能是由于Cdr1as 通过miRNA 海绵效应抑制miRNA-7 的活性，减轻miRNA-7 对PARP 与SP1 的抑制，进而增加心肌细胞凋亡导致AMI 加重。DENG 等［32］在AMI 患者血液样本中发现circRNA_081881 表达降低近10 倍，生物信息分析预测表明circRNA_081881 也可以通过结合miRNA-548，其中miRNA-548 可以负性调控AMI保护因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ）的抑制，因此，circRNA_081881 与miR-548以及PPAR-γ的相互调控为AMI 的治疗提供了有吸引力的靶点。

5 结论

总之，不同来源的circRNAs 可产生不同类型的circRNAs 并分别具有不同的生物学功能如吸收miRNA、调控基因转录以及翻译蛋白质等，促使circRNAs 介导多种疾病的发生和发展。其中在冠心病调控过程中，大多数circRNAs 是通过miRNA 海绵形成调节冠心病相关蛋白表达的circRNA-miRNA 信号轴来发挥作用。尽管circRNAs的发现已有40 余年，但circRNAs 在As、MI 以及其他心血管疾病中的作用研究仍处于起步阶段，进一步验证circRNAs 的功能来揭示其在冠心病中的作用及分子机制是有必要的。首先，需要制定检测外周血以及组织中circRNAs 水平的标准化方法；其次，应将circRNAs 表达水平标准化进而建立正常基线来区分冠心病患者和健康人。除了miRNA 海绵作用，circRNAs 其他作用机制如转录及翻译的调节在冠心病中的作用仍需要进一步探索；心肌组织中的circRNAs 是否会被其他组织吸收产生继发效应仍待明确。随着精准医学的出现，疾病的诊断和治疗将逐渐聚焦于分子遗传学，circRNAs 作为生物标志物与治疗靶点在冠心病的防治工作中呈现出巨大希望。但由于诊断的局限性以及脱靶效应的限制，将circRNAs 应用于临床实践中仍任重而道远。