miRNA 在干燥综合征中的研究进展

陈敏 李文倩 李栋 沈括

1青海大学研究生院（西宁810007）；2青海省人民医院（西宁810007）

干燥综合征（Sjögren's syndrome，SS）是一种影响外分泌腺和多器官系统的慢性自身免疫性疾病。其前期主要累及泪腺及唾液腺等外分泌腺，腺体功能障碍后可出现口干、眼干等不适［1］，后期加重可累及呼吸系统、血液系统以及肝脾等器官［2-3］。SS 的致病机制错综复杂，目前对其病因尚无法明确阐明。病毒感染可成为其始动因素之一，主要病理特点为外分泌腺中B 细胞过度激活，成熟聚集形成异位生发中心，引发自身免疫［4］。同时临床研究发现SS 也与雌激素紧密相关［5］。虽然目前抗SSA 和抗SSB 抗体已经纳入SS 的诊断标准，但是由于其特异性和敏感性欠佳［6］，且SS 的临床症状类似于其他免疫病，导致SS 容易漏诊和误诊。为了进一步探索SS 的发病机制及相关标志物，国内外开始进一步深入研究调控SS 的相关因素，在一些相关实验及其他免疫病研究中发现，某些miRNA 不但可能与SS 发病机制中病毒感染、B 淋巴细胞、自身抗原、雌激素等方面有关联，而且在SS 与其他免疫性疾病间的鉴别也具有一定的作用［7-8］，这些发现对SS 的研究指明了新的方向。通过研究表明miRNA 是高度保守的小非编码RNA 分子，它可以通过与mRNA 的3′非翻译区域互补序列结合调节mRNA 的降解和翻译抑制，进而可调控SS 不同阶段的演化。本文综述了近年来miRNA 在SS 中的研究进展。

1 miRNA 的合成和作用机制

miRNA 是非编码RNA 的分子之一。它们广泛存在于动植物及病毒中。通常，miRNA 基因在细胞核中经RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ）的催化作用转录得到初始miRNA（pri-miRNA），长度大约为300～1 000 nt，pri-miRNA经过Drosha 酶处理后，成为前体miRNA（pre-miRNA），长度大约为70～90 nt，为一茎环结构；pre-miRNA 再经过Dicer酶处理后，成为长约20～24 nt 的成熟miRNA［9］。但是目前尚不知新生的miRNA 是如何免受核糖核酸酶清除的，如单核细胞趋化蛋白诱导蛋白1 可以降解miRNA，避免miRNA 的产生［10］。miRNA 在转录后水平通过降解和翻译影响mRNA 基因的表达，几乎调控所有的生理及病理过程。2002年CALIN 等［11］发现miR-15/miR-16 在人慢性淋巴瘤中表达下调，首次将miRNA 的研究与人类疾病相关联。此后miRNA 的研究在多种疾病领域广泛开展。近年来在免疫性疾病领域中，越来越多的miRNA 被研究发现参与类风湿关节炎［12］、系统性红斑狼疮［13］、SS［4］、系统性硬化症［14］、银屑病［15］等疾病的发病机制。miRNA 在SS中研究刚刚起步，miRNA 可能调节SS 的病理演化，但研究发现每个miRNA 具有多个靶点，与mRNA 形成复杂的调控网络［16］，这决定了miRNA 错综复杂的功能，及对SS 复杂的调控方式。

2 miRNA 在SS 中的作用

2.1 病毒miRNA 与SS 病毒感染能导致SS 发生已经成为共识。近年来发现病毒miRNA 的入侵可以成为pSS 发生的始动因素主要在两方面。一方面，病毒miRNA 直接侵入免疫细胞和靶器官［17］影响靶细胞膜上的相关通道功能。GALLO 等［18］研究发现EBV-miR-BART13-3p 在pSS 患者唾液腺中显著差异表达，并通过实时定量PCR 证实在独立样本中EBV-miR-BART13-3p 上调可达22 倍以上，通过RNA22 和RNA 混合算法预测识别EBV-miR-BART13-3p 在唾液腺分泌功能相关基因mRNA 上的靶点，在这些功能相关基因中，基质间分子1（stromal interacting molecule 1，STIM1）和水通道蛋白5（aquaporin5，AQP5）脱颖而出。STIM1 蛋白可通过感受内质网钙离子浓度的改变，将信号传递到胞质后，最终激活细胞膜上的钙离子通道，钙离子内流是触发腺体分泌的必要因素，而STIM1 蛋白的活性降低将影响钙离子进入腺体细胞，导致外分泌腺功能障碍［19］。AQP5 是位于人唾液腺腺泡细胞顶膜上的一种重要的水通道，据国外相关研究显示AQP5 的异常分布与唾液腺的功能减退明显相关［20］。他们预测EBV-miR-BART13-3p 的两个靶点在STIM1 的3′UTR 端，一个在编码序列，一个靶点在AQP5 的3′UTR 端，在体外试验中通过荧光素酶质粒建立和荧光素酶报告分析得到验证。为了进一步明确EBV-miR-BART13-3p 在pSS 中的确切作用，通过PCR 及Western blot 发 现EBV-miR-BART13-3p 导 致STIM1 蛋 白 翻译抑制而不降低STIM1 的转录本。由于STIM1 是SOCE 的主要调控器，Ca2+通过SOCE 内流需要活化T 细胞核因子（nuclear factor of activated T，NFAT），为了评估EBV-miRBART13-3p 诱导的STIM1 和SOCE 减少是否是影响了NFAT 的激活，研究人员通过将带有EBV-miR-BART13-3p的GFP-NFAT 质粒转染到唾液腺中后发现转染后的唾液腺中NFAT 激活减少，这说明EBV-miR-BART13-3p 诱导STIM1 下调导致SOCE 及相关Ca2+内流依赖基因表达中断。并且，GALLO 等通过使用LNA 稳定的mlRNA 探针进行了原位杂交，发现EBV-miR-BART13-3p 主要存在于在腺泡和导管细胞中，特别是那些被炎症细胞包围的细胞。但EBV-miR-BART13-3p 由EBV 编码，通常在被病毒感染的细胞中检测到，而EBV 在慢性期间的潜在感染的主要靶点是B 淋巴细胞。GALLO 等［18］通过唾液腺上皮细胞与EBV 感染的B 淋巴细胞共培养试验证实EBV-miR-bart13-3p 可以通过外泌体从B 细胞转移到唾液上皮细胞，最终下调STIM1 蛋白的活性。但EBV-miR-bart13-3p 如何下调AQP5的表达目前尚不清楚，因此，进一步明确EBV-miR-bart13-3p 对AQP5 的调节机制，可作为新的研究思路，干预此过程可能对SS 的临床症状有明显缓解作用。

另一方面，病毒miRNA 入侵可促进宿主B 淋巴细胞固有的miRNA 上调。COTRIM 等［21］发现，miR-181a 在B 细胞遭受EBV-miRNA 入侵后上调，引发了病毒miRNA 驱使宿主miRNA 的差异表达的一种猜想。miRNA-181a 可促进B细胞增殖，抑制CD8+T 细胞。而有相关报道miR-181a 的高表达可以抑制正常小鼠中CD4+T 淋巴细胞的凋亡［22］。以上表明病毒miRNA 可能不止直接作用于靶腺细胞，还可通过与宿主miRNA 建立某种联系，继而使宿主miRNA 差异表达间接在SS 中起作用，但具体通过某种机制建立联系尚不清楚。

2.2 miRNA 对B 淋巴细胞的功能 SS 的免疫病理形成过程中，显著特点为B 淋巴细胞过度激活，在受影响的外分泌腺中形成生发中心，产生特异性抗体，进而出现自身免疫反应，CHEN 等［8］发现miR-223-5p、miR-150-5p、miR-155-5p 和miR-342-3p 的表达水平与外周血单个核细胞中的B细胞比例有关。近年进一步研究发现miRNA 在B 淋巴细胞的增殖、活化、凋亡、功能等方面具有明显作用。

脂多糖刺激及EB 病毒感染B 淋巴细胞后导致miRNA-146a 在免疫紊乱的患者中呈现高表达，如类风湿性关节炎、SS［23-24］｛Srivastava，2017 #309；Elsayed，2016 #310；Gauna，2015 #311｝｛Gauna，2015 #311；Elsayed，2016 #312；Srivastava，2017 #313｝。这种miRNA 的有效靶点包括干扰素调节因子5、信号转导和转录激活子1 和白介素1受体相关激酶，且与SS 的基因变异或DNA 甲基化有关［25］。在一项构建了一株高表达miRNA-146a 的转基因小鼠试验中发现miR-146a 直接靶向B 细胞表面Fas 蛋白，减弱Fas 凋亡作用，从而促进B 细胞扩增［25］。另一方面发现miR-146a 可抑制唾液腺细胞上共刺激分子CD80 表达下调，增高共刺激分子CD86：CD80 的比例［24］。CD80 和CD86为表达在未成熟B 细胞表面的黏附分子，CD80 为B 细胞增殖提供负向调节信号，CD86 可增强B 细胞的成熟促进B 细胞的增殖，二者的比例对B 细胞的增殖和成熟起异常关键的作用［26］。这说明了miRNA-146a 可促进B 细胞稳态扩张。通过检测miRNA-146a 可为SS 早期诊断提供依据，通过干预中间调节过程为治疗SS 提供了新的方向。

2018年，WANG-RENAULT 等［27］进一步优化实验首次运用磁珠分选法将CD4+T 淋巴细胞和CD19+B 淋巴细胞从单个核细胞中分选纯化，并研究两种细胞中miRNA 的差异表达，结果发现，has-let-7d-3p、has-miR-155-5p、has-miR-378a-3p 等在CD4+T 淋巴细胞中差异表达，has-miR-378a-3p、has-miR-30b-5p、has-miR-26a-5p 等在CD19+B 淋巴细胞中差异表达。且发现CD19+B 淋巴细胞中，has-miR-30b-5p与B 细胞激活因子（B lymphocyte stimulator，BAFF）-mRNA负相关，功能试验进一步验证，当has-miR-30b-5p 抑制后BAFF 上调。BAFF 为B 淋巴细胞表面的活化因子，在B 细胞的增殖、激活、杀伤作用方面有关键作用，而miRNA 通过靶向BAFF mRNA 的3′UTR［28］来调节BAFF 的表达，从而降低B 淋巴细胞活化增生［8］。BAFF 抑制后可减少唾液腺损害，减低自身抗体滴度［29］。

近期研究发现在SS 患者腺体组织中miR-150-5p 表达降低，通过进一步研究表明miR-150-5p 与促进B 细胞的分化与激活，增加B 细胞在单个核细胞中的比例有关［8］。故miR-150-5p 在SS 腺体中的低表达可能减弱B 淋巴细胞的增殖作用，这对减缓SS 的病理演化可能有一定的意义。

综上所述，SS 的演化可能与两大类作用相反的miRNA的平衡失调有关，促进B 细胞激活类miRNA 高表达可加速pSS 进程，而抑制B 细胞活化增生的miRNA 可减缓病情演化及临床症状，但都需要进一步深入研究去探索miRNA相互间的关系，以及调控机制。

2.3 miRNA 对雌激素受体的调节作用 既往对miRNA 差异表达的研究多停留在单个核细胞中，WANG-RENAULT等［27］通过进一步优化实验首次对单个核细胞中的T、B 淋巴细胞进行纯化后发现hsa-miR-378a-3p，hsa-miR-222-3p在pSS 患者B 淋巴细胞中差异表达。近年有学者在乳腺癌研究中发现hsa-miR-378a-3p 在乳腺癌组织中的表达下调，此外miR-378a-3p 的低表达与他莫昔芬治疗的乳腺癌患者预后不良有关，推测miR-378a-3p 可能与雌激素相关受体表达及敏感性有关［30］。同样在乳腺癌组织中，雌激素受体阴性表达的乳腺癌组织中miR-222 表达明显高于雌激素受体阳性的癌组织中，并且miR-222 参与他莫昔芬抵抗，故可推测miR-222 可能参与雌激素受体的负性调节［31］。而经过临床研究SS 更年期女性多发，与雌激素降低紧密相关［5］。hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-222-3p 都可能负性调节雌激素受体，而导致机体对雌激素不敏感，导致雌激素水平相对不足，而构成SS 的发病因素之一。通过研究miRNA 与雌激素的关系可为研究SS 发病原因提供新的思路。

2.4 miRNA 对SS 相关抗原Ro/SSA 和La/SSB 间的关系 组织高表达Ro/SSA 和La/SSB 自身抗体对于SS 自身免疫系统体液免疫的产生和持续至关重要。现在普遍认为SSA/Ro 分为Ro52 和Ro60 两种 多肽分子，而Ro52 是TRIM蛋白家族成员（TRIM 21），而Ro60 为TROVER 蛋白成员（TOVER 2）。GOURZI 等［32］发现，在小唾液腺中，let7b、miR-16、miR-181a、miR-223 和miR-483-5p 与Ro52/TRIM21mRNA 正相关。在长期培养的唾液腺细胞中miR-181a和miR-200b-3p与Ro52/TRIM21和Ro60/TROVE2mRNA负相关。Let7b、miR-200b-5p 和miR-223 与La/SSBmRNA 相关。YING 等［33］发现miR-1207-5p、miR-4695-3p 下调可导致唾液腺TRIM21 升高。LIANG 等［34］进一步发现SSB 可通过识别pre-miRNA 的茎环结构并结合后可以保护pre-miRNA免受核酸酶，这意味着pSS 相关自身抗原可以结合相关miRNA，减缓miRNA 的降解，二者协同可推进SS 的演变。

虽然实验发现的与SSA、SSB 相关miRNA 逐渐增多，但大多局限在表达水平，需要进一步实验明确相互关联及调节过程的级联方式，为SS 的治疗提供新的可能。

3 miRNA 在SS 与其他免疫性疾病中的鉴别作用

pSS 由于临床表现的多样性，导致误诊率和漏诊率较高。近年来发现，一些在pSS 中特异性表达的miRNA 有助于pSS 与其他免疫性疾病的鉴别。2017年，SUN 等［35］访问了Pubmed、万方、知网、维普等数据库，采用95%置信区间标准差，通过建立随机效应模型研究miRNA-146a 表达与两种疾病的关系，在Meta 分析中总共包括了6 项研究，其中158 例病例和124 例对照。Meta 分析结果显示miRNA-146a 表达与pSS 的风险相关，而与SLE 风险无关。同时SLE 亚群分析（外周血单个核细胞和血清）证实了这一结果。因此，miRNA-146a 可以作为一种用于诊断pSS 的新型生物学标志。同年，CHEN 等［8］第一次对两种自身免疫性疾病之间的miRNA 表达谱的变化进行了研究，他们在SLE患者中有135 种，而在pSS 患者中有26 种miRNAs 表达改变，虽然许多miRNA 在二者中表达有重叠，如miR-146 a、miR-16、miR-21 在内的25 个miRNAs 在pSS 与SLE 中均呈高表达，但是发现miR-150-5p 在pSS 中下调，在SLE 中上升表达，这是pSS 中一个新颖而独特的发现。除此之外，几种miRNAs 在SLE 中过度表达却在pSS 中没有变化，如miR-148a-3p、miR-152、miR-155、miR-223、miR-224、miR-326 和miR-342。这些发现对于SS 与其他自身免疫性疾病的鉴别提供了一个新的可选择方法。

4 展望

SS 涉及的致病机制纷繁复杂，miRNA 调控涉及SS 病程的多个过程，且由于一个miRNA 可调节多种基因表达这种特殊的调控方式，一旦找到某种涉及多方面调控SS致病过程的关键miRNA，对其进行靶向药物治疗后，极有可能对SS 的临床症缓解有显著效果。随着对miRNA 的差异表达水平及相关性深入研究增多，必然会进一步揭示相关miRNA 的功能及调控方式。这对于早期诊断、疾病鉴别、预后等具有重要意义，甚至特效靶向治疗药物的发现都将成为可能。