猪流行性腹泻病毒诊断方法及防控措施

翟豫文 段静茹 黎 明 刘俊山 刘 朔

(1.漯河市动物卫生监督所,河南漯河 426000;2.漯河市畜产品质量安全检验检测中心,河南漯河 426000)

1 RT-PCR方法

随着近几年PCR技术的不断发展和更新，猪流行性腹泻病的诊断效率也得到快速有效的提高。以猪流行性腹泻病毒基因序列为基础建立的RT-PCR检测方法对细胞分离株和临床样品的粪便进行检测。韩国Kim O等人将此项技术更进一步推进，在发现猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病易混合感染时，建立了同时诊断这两种病毒的二重RT-PCR方法。此外，国外还有学者在此基础上建立了可以同时检测三种病毒的检测方法以及检测猪流行性腹泻病的实时荧光PCR检测方法。与荧光检测方法相应的环介导恒温扩增技术也成为了一种新的检测手段被广泛应用。PCR检测方法虽然有着良好的敏感性和特异性，但是由于所用的设备和人员操作的限制，只能适用于实验室诊断，不适合基层检测使用。

2 ELISA检测方法

近几年检测技术的发展日新月异，除了分子生物学检测方法外，还有常用的血清学检测方法，如ELISA方法。ELISA检测方法具有特异性高，灵敏度高、操作简便，结果判定容易等优点被广泛应用于大批量样品的检测。ELISA检测方法不但可以对抗体进行检测，还可以对抗原进行检测。此外，在实验室和现场检疫均适用。ELISA检测方法也是世界卫生组织公认的国际标准之一。ELISA检测方法的种类非常多，常见的有双夹心ELISA方法、竞争ELISA方法、间接ELISA方法、斑点ELISA方法等。其中猪流行性腹泻病毒的N蛋白、S蛋白和M蛋白常用来作为抗体建立ELISA检测方法。

3 免疫荧光法

在猪流行性腹泻病毒的检测方法当中，免疫荧光方法是一种常用的特异性强、灵敏度高的方法，同时也是研究人员用以验证新方法建立的辅助方法。如任晓峰在建立的猪流行性腹泻病毒M蛋白检测抗体ELISA方法的基础上，用间接免疫荧光方法验证了含有猪流行性腹泻病毒蛋白检测抗体ELISA的基础上，用间接免疫荧光实验证实。猪流行性腹泻病毒膜蛋白血清能够与Vero细胞进行反应，取猪肠道组织切片经过荧光抗体染色后，2小时内就可以得到结果。免疫荧光检测方法灵敏度高，但是对样品要求非常高，不适合在实践中批量检测[1]。

4 电镜法

利用电镜方法观察，可以清晰的看到病毒内部的结构、形状，进而判定病毒的类型。猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎属于同一个病毒属，而且都可以引发不同日龄的猪只发病，因为两种病毒引起的猪腹泻的临床症状比较类似，很难从发病猪临床上诊断出来病种类型，但是电镜观察法可以有效地、直接地观察和鉴别出是哪一种病毒引起的发病。其中，猪流行性腹泻 病毒粒子的纤突顶球较小，底部较为短，排列非常密集，这与传染性胃肠炎的病毒粒子区别也非常小，且两种病毒粒子并没有免疫交叉反应，这证明两种病毒粒子没有共同的抗原。电镜方法简单、直观、快捷，但是电镜方法设备繁琐，不适用于大规模、大批量检测。

5 免疫组化法

最早的免疫组化是利用噬菌体抗体系统在单克隆抗体的基础上对PEDV建立了免疫组化方法，这个实验严证实了该抗体作为免疫组化检测一抗的可行性。免疫组化方法检测的灵敏度非常高，能够较好的对猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病进行有效区分。但是该检测方法所需时间较长，成本非常高，在大批量的检测当中并不适用。

6 血凝试验

猪流行性腹泻病毒不具有血凝作用，因此无法进行血凝试验。但是可以用猪流行性腹泻病毒致敏醛化鞣酸化细胞，由此建立一种猪流行性腹泻病毒的间接血凝试验。

7 环介导等温扩增技术

科研工作者针对猪流行性腹泻病毒的N基因设计了6对引物，建立了检测猪流行性腹泻病毒的等温扩增技术。这种检测技术只需要63℃反应50min，然后凝胶电泳即可看到结果，相对于ELISA和RT-PCR方法，更为快捷简便。

8 免疫防控措施

猪流行性腹泻病的防控主要是以预防为主，在日常生产中要提高饲养管理水平，做好圈舍和场地的消毒工作、病猪的隔离工作。对于进出猪场的人员和车辆要严格进行消毒，对于患病猪群要及时进行分栏处理。另外，也是最为重要的，就是用商品化的疫苗来预防猪流行性腹泻病的发生，常用的疫苗有组织灭活苗、细胞弱毒苗和转基因疫苗。组织灭活苗主要是让仔猪口服猪流行性腹泻病毒毒株，等仔猪出现临床症状后，剖检取出猪肠内容物，将其捣碎，制作成乳剂，混合甲醛灭活后与氢氧化铝佐剂混合一起制作成灭活疫苗。虽然这种方法切实有效，但是制作疫苗的成本较高，不适合被广泛应用。随着疫苗的需求不断加大，各种弱毒苗也纷纷被研究出来，尤其是病毒在细胞上传代次数达到一定量时，病毒会有一定的致弱现象，从而获得弱毒疫苗。弱毒疫苗的应用所产生的免疫保护作用与接种剂量有直接的关系。低剂量的疫苗免疫保护率较低，高剂量的疫苗，免疫保护率较高。随着基因载体系统和遗传转化技术的发展，猪流行性腹泻病的转基因疫苗被作为一个新的研究方向开发出来，试验证明，转基因疫苗可以刺激机体产生较强的免疫应答，起到一个很好的免疫保护作用。