钙调磷酸酶抑制剂的抗真菌作用研究进展

廖 勇，敖俊红，杨蓉娅

随着免疫缺陷患者数量的逐年增加，机会性真菌感染在临床中也越来越常见，最常见的病原真菌包括：念珠菌属、隐球菌属和曲霉菌属[1]。目前针对上述病原真菌引起的深部真菌病可选择的抗真菌药物种类较少，且均存在不同程度的不良反应；同时，这些药物长期临床应用可能出现诱导耐药现象[2]。所以，临床需要进一步研发新的抗真菌药物或拓展新的抗真菌治疗策略，从而增加治疗选择，降低药物不良反应，并减少原有抗真菌药的获得性耐药[3]。因此，针对新的靶点探寻新的抗真菌治疗策略具有重要的临床意义[4]。

1 钙调磷酸酶与病原真菌

钙调磷酸酶（calcinurin）是受Ca2+和钙调蛋白（calcineurin，CaM）调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶[5]。近年的研究发现，钙调磷酸酶是多种病原真菌调节细胞内钙离子稳态的重要调节蛋白，Ca2+/钙调磷酸酶信号途径调节酵母菌和丝状真菌多种重要的细胞内应答反应[6]。白念珠菌的钙调磷酸酶是由催化亚基（CnA）和调节亚基（CnB）组成的异源二聚体[5]。在环境压力作用下，Ca2+通过细胞膜上的钙转运蛋白或钙通道进入细胞质，并结合CaM；随着胞质内Ca2+浓度的增加，其激活细胞内钙调磷酸酶；钙调磷酸酶去磷酸化细胞内的转录因子（Crz1），Crz1 再快速进入细胞核诱导靶基因的表达；从而进一步调节细胞的多种功能[7]。研究发现，钙调磷酸酶在细胞生长、形态转换、阳离子稳态和应激应答中发挥重要作用[6]。钙调磷酸酶抑制剂通过与该信号通路相关蛋白相互作用，从而抑制细胞内钙调磷酸酶活性[8,9]。目前临床常用的钙调磷酸酶抑制剂包括：环孢素、他克莫司和匹美莫司；系统应用主要用于器官移植术后抗排异治疗，局部外用主要用于特应性皮炎的治疗。如环孢素与亲环蛋白A 结合后，抑制CaM 与钙调磷酸酶的作用，从而阻断该信号通路[10,11]。

2 钙调磷酸酶抑制剂的抗真菌作用

常用抗真菌药多数靶向病原真菌的细胞膜或细胞壁，唑类抗真菌药抑制真菌麦角固醇的生物合成通路，通过影响真菌细胞膜的完整性引起细胞应激反应；棘白菌素类抗真菌药通过非竞争性抑制真菌β-葡聚糖合成，从而影响真菌细胞壁完整性而引起细胞应激反应；最终，药物通过上述作用方式达到抑菌或杀菌作用[12]。钙调磷酸酶调节的信号通路也被证明通过调节下游的反应元件影响麦角固醇、β-葡聚糖和几丁质的生物合成，从而在真菌细胞应激反应的应答时影响细胞膜和细胞壁完整性[13-15]。对酿酒酵母的研究发现，Ca2+/钙调磷酸酶信号通路在酿酒酵母对唑类抗真菌药物和特比萘芬的敏感性中发挥重要作用[16]。近年来，越来越多的研究发现Ca2+/钙调磷酸酶信号通路与病原真菌对抗真菌药的耐药表型相关[17]。如钙调磷酸酶抑制剂联合常用抗真菌药被证明可抑制耐药菌株的生长[18]。因此，阻断钙调磷酸酶信号通路目前被认为是一种新的针对深部真菌病的抗真菌策略，既可以提高现有抗真菌药的抗真菌效果，联合应用时也可部分阻断病原真菌出现耐药[19]。基于钙调磷酸酶在病原真菌生长及耐药中的重要作用，近年来越来越多的研究也关注其作为抗真菌靶点的潜在临床价值[20]。

研究发现，钙调磷酸酶信号通路可调节念珠菌属真菌对抗真菌药的敏感性[19]。钙调磷酸酶抑制剂与唑类抗真菌药联合应用时，可将唑类抗真菌药对白念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌的抑菌作用转变为杀菌作用[21,22]。白念珠菌和都柏林念珠菌的钙调磷酸酶/Crz1基因突变株均显示出对唑类抗真菌药和棘白菌素类抗真菌药的敏感性增加[23-25]。但另一方面，鲁希特念珠菌只有钙调磷酸酶基因突变株对唑类抗真菌药敏感性增加，其Crz1基因突变株对唑类抗真菌药敏感性下降；上述结果提示鲁希特念珠菌存在非钙调磷酸酶依赖的耐药途径[26]；同时也说明不同种属病原真菌的耐药机制有所不同。体外药敏实验证实，环孢素（钙调磷酸酶抑制剂）联合氟康唑对于唑类耐药白念珠菌具有协同作用[27]。他克莫司（FK506，钙调磷酸酶抑制剂）与卡泊芬净联合对棘白菌素耐药的都柏林念珠菌或鲁希特念珠菌具有协同作用[23]。FK506 联合唑类抗真菌药对唑类耐药念珠菌临床株也具有一定程度的协同作用[28]，说明联合用药对耐药念珠菌感染治疗具有潜在临床价值。此外，针对麦角固醇合成通路其他靶点的抗真菌药，如特比萘芬，也显示出与环孢素的协同抗念珠菌作用[22]。对小鼠念珠菌性心内膜炎的研究证明，接受氟康唑联合环孢素治疗小鼠的心内膜原发性损害和肾脏播散性继发性损害的改善优于接受氟康唑、两性霉素B或环孢素单药治疗方案的小鼠[29]。

对新生隐球菌的研究发现，环孢素和FK506 均可抑制其在37℃下的生长[30]。尽管FK506 与氟康唑联合显示出协同抑制新生隐球菌作用，但该表型与钙调磷酸酶通路无关，提示FK506 可能具有其他抗新生隐球菌的药物靶点[31]。与新生隐球菌不同，研究发现钙调磷酸酶在格特隐球菌的氟康唑耐药中发挥重要作用，提示钙调磷酸酶在不同菌种间的耐药表型存在差异[32]。一项对器官移植后伴发新生隐球菌感染患者的回顾性研究发现，在接受抗真菌治疗方案一致，使用钙调磷酸酶抑制剂（环孢素或FK506）作为抗排异药物的患者预后明显优于接受其他类型抗排异药物（硫唑嘌呤或酚酸酯）患者的预后[33]。

研究发现，针对HSP90-钙调磷酸酶信号通路的抑制剂对多种丝状真菌的生长也具有抑制作用[34]。对烟曲霉的研究发现，CrzA（Crz1同源基因）在其β-葡聚糖生物合成中发挥一定调节作用[35]。体外药敏试验发现，单独应用钙调磷酸酶抑制剂（环孢素或FK506）对烟曲霉的生长具有抑制活性[36]；同时，也可增强伊曲康唑或棘白菌素类抗真菌药的抗烟曲霉活性[37]。此外，钙调磷酸酶抑制剂可将原本卡泊芬净对烟曲霉的抑菌作用转变为杀菌作用[38]。钙调磷酸酶抑制剂被证明对烟曲霉不同的唑类或棘白菌素类耐药临床分离株均具有抗菌活性[39]。对可引起毛霉病的球囊菌纲病原真菌的体外药敏实验发现，钙调磷酸酶抑制剂可显著提高该类病原菌对卡泊芬净的体外敏感性，且部分组合显示出协同作用[40]。

通过梯度浓度诱导耐药的模型研究发现，钙调磷酸酶抑制剂（环孢素）可明显降低氟康唑或伏立康唑诱导白念珠菌临床株对其产生的耐药表型，但钙调磷酸酶抑制剂对于黄曲霉的唑类药物（氟康唑或伏立康唑）诱导耐药表型无影响；研究同时发现，钙调磷酸酶抑制剂对于白念珠菌的卡泊芬净诱导耐药无影响[19]。另一项关于氟康唑联合钙调磷酸酶抑制剂（FK506）对白念珠菌耐药表型的研究发现，通过体外诱导获得的氟康唑耐药表型是依赖HSP90-钙调磷酸酶通路，而从长期接受氟康唑治疗患者（2 年）分离到的氟康唑耐药株其耐药表型是非HSP90-钙调磷酸酶通路依赖的。同时，体外联合用药时出现的氟康唑耐药同样与HSP90-钙调磷酸酶通路相关，说明复杂的体内环境以及长时间的氟康唑暴露与可控条件下体外诱导获得的耐药方式之间存在一定差异，从而影响白念珠菌对选择性环境压力的应答反应[41]。上述研究提示，早期应用钙调磷酸酶抑制剂可能阻断部分病原真菌因为使用抗真菌药所出现的临床耐药问题。

3 展望

由于目前抗真菌药物种类较少，且不断出现的临床耐药现象，而联合使用针对钙调磷酸酶通路靶点的抗真菌治疗策略可能获得较好的临床预后[17,19,20]，特别是针对临床常见的、白念珠菌氟康唑耐药具有潜在临床价值[42]。目前临床使用的钙调磷酸酶抑制剂（环孢素或FK506）由于其免疫抑制作用，不可能作为抗真菌药物被临床使用；但研发和应用特异性靶向真菌钙调磷酸酶通路，而与宿主无交叉反应（对宿主免疫功能无影响）的环孢素或FK506 衍生物具有一定的临床意义，从而避免在抗真菌治疗过程中出现对宿主的免疫抑制[20]。新的药物研发进展已经可以设计并合成无免疫抑制作用的钙调磷酸酶抑制剂，为后续临床应用提供选择。已经有两种无免疫抑制作用的环孢素衍生物被证实具有抑制新生隐球菌钙调磷酸酶的活性，抑制剂L-685 和L-818 对宿主无明显免疫抑制作用，但可有效抑制新生隐球菌及其氟康唑耐药株的生长，且其抑制效果与FK506 类似[43]。

如上所述，还需要进一步更为深入的机制研究，特别是钙调磷酸酶调控网络中抗真菌有效靶点的研究，以及设计和检测无免疫抑制作用的钙调磷酸酶抑制剂，从而安全应用于临床抗真菌治疗，提高深部真菌病患者的临床预后，并降低常用抗真菌药的临床耐药。