自噬与线粒体功能障碍在帕金森病进展中的作用

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种严重危害中老年人健康,以黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性丢失为主要病理特征的一类神经退行性疾病。PD病人主要表现为运动迟缓、姿势不稳、静止性震颤和肌肉僵硬等症状，有的病人还伴有不同程度的抑郁症状、言语不清、痴呆或生活不能自理[1]。在我国65岁以上人群中PD的发病率约2%,占世界PD病人总数的40%以上,且有逐年增高的趋势,预计未来10年内我国罹患PD的人数将占全球病人总数的60%以上,给国家和家庭带来更加沉重的负担。PD主要与黑质致密部多巴胺能神经元的渐进性变性坏死以及由α-突触核蛋白构成的被称为路易小体的神经炎性物质在黑质多巴胺神经元内的聚集密切相关[2]。尽管导致多巴胺能神经元变性坏死的机制尚不清楚,但包括蛋白质积聚、泛素-蛋白酶体通路受损、氧化应激、自噬与线粒体功能失调以及神经炎症等在内的多种因素已被证实与PD的发病机制密切相关。在临床上,大多数PD病人都是散发的,且与PD发病机制相关的常染色体显性和隐性基因突变的遗传家系在过去的研究中已被证实。此外，环境因素也可能直接或间接对线粒体功能产生调控作用。

自噬是将功能失调的细胞器、错误折叠的蛋白质、多余或不必要的细胞质内容物运送到溶酶体来降解的细胞分解代谢过程,是真核生物所特有的生命现象,对于维持细胞的正常功能具有重要意义[3]。线粒体自噬为自噬线粒体选择性清除受损线粒体的唯一途径,可通过减少呼吸活动和降低膜电位来维持线粒体完整性,从而减少活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生,以保证细胞内线粒体能够正常发挥作用。越来越多的证据表明，自噬缺陷参与了PD的发病过程。线粒体功能障碍主要表现为ROS的过度产生、三磷酸腺苷(ATP)合成障碍、线粒体DNA(mtDNA)耗竭、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)释放以及电子传递复合体(ETC)的缺陷等[4]。与PD相关的基因主要包括:(1)SNCA基因,其编码的α-突触核蛋白为路易小体的主要组成部分[5];(2)LRRK2基因,其编码多域大蛋白物质,可导致超过10%的家族性和大约3%的散发性PD的发生[6];(3)PINK1和PARKIN基因,主要参与线粒体代谢的调节和细胞内线粒体质量和能量生成的维护,它们的突变体与早发型PD密切相关[7];(4)DJ-1基因,可与活性氧反应,并通过降低自身的等电点来消除活性氧的毒性作用,可导致约1%～2%常染色体隐性遗传性PD的发生。本文将讨论PD相关基因对自噬和线粒体功能调节的作用及其调节代谢途径在PD进展中的作用,同时也将对环境因素在自噬与线粒体功能障碍中的影响进行初步探讨。

1 PD相关基因参与细胞自噬和线粒体功能失调

1.1α-突触核蛋白与SNCA基因α-突触核蛋白由SNCA基因编码,其功能多样,可参与到突触结构的维持、神经可塑性以及多巴胺的摄取与调控等多方面,能够与线粒体内膜结合,抑制线粒体复合体Ⅰ、Ⅸ的功能并增加自由基的释放。α-突触核蛋白可以通过与腺苷酸转位作用或电压依赖性阴离子通道来激活线粒体通透性转换孔(mPTP),进而通过开放mPTP破坏线粒体的膜电位引发多巴胺神经元的损伤[8]。泛素-蛋白酶体系统(abiquitin proteasome system,UPS)可以特异性降解细胞内突变、氧化损伤、错误折叠或有害的蛋白质。α-突触核蛋白主要由UPS降解,UPS的功能缺陷可导致错误折叠的α-突触核蛋白单体及寡聚体降解受阻、胞浆内路易小体形成及多巴胺神经元变性坏死,而α-突触核蛋白的过度聚集又可损害UPS功能,可见,α-突触核蛋白的聚集和UPS功能缺陷互为因果,加速了中枢神经系统的损伤。过多的α-突触核蛋白还可通过抑制Rab1进而干扰自噬小体的形成与降解。在PD病人死后的大脑组织研究中我们得知，α-突触核蛋白的过度积聚激活了氧化应激并且干扰了线粒体的自噬功能,更重要的是无论在体内还是体外,α-突触核蛋白的过度表达均可引起神经元中线粒体的分裂和活性损伤,最终导致呼吸链功能的下降和神经元的死亡[10]。α-突触核蛋白的过表达可以通过细胞外信号调节激酶(ERK途径)、诱导线粒体细胞色素C的释放以及影响Caspase-9/-3活性显著提高线粒体分裂蛋白DRP1的转运，进而促进细胞凋亡[11]。相反,在体外抑制α-突触核蛋白的过表达可阻止1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导的线粒体分裂。

1.2 PINK1基因 PINK1是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白,在整个大脑和大多数细胞类型中广泛表达,已知PINK1 基因中有40多个突变体与PD的常染色体隐性遗传密切相关。在生理条件下,PINK1不能作为标签发挥作用,PINK1不断的从胞浆输入到线粒体中,在线粒体被最终降解。当线粒体损伤时,受损的线粒体膜电位阻断了PINK1的线粒体输入,导致其在外膜累积,成为受损线粒体的标签;当PINK1在线粒体外膜累积时,可磷酸化外膜上的Parkin,磷酸化的Parkin与泛素结合后发生构象改变并被激活,活化Parkin泛素化电压依赖性阴离子通道，融合蛋白Mfn1和Mfn2。这些线粒体泛素链可以与自噬受体相互作用,如OPTN(optineurin)和核点蛋白52,通过结合自噬体γ-氨基丁酸(GABA)A受体相关蛋白招募线粒体周围的自噬体膜;最后,这些线粒体自噬体被运到溶酶体清除。PINK1作为Parkin的上游因子,可通过线粒体的去极化作用积聚在线粒体表面，并可募集 Parkin到线粒体的表面[12]。作为一种线粒体蛋白,PINK1在线粒体自噬、线粒体转运、线粒体动力学和复合体I活性中扮演着重要角色。线粒体的去极化可诱导PINK1/Parkin与可募集驱动蛋白到线粒体表面的一种被称为Miro的蛋白相互作用。PINK1磷酸化Miro蛋白来诱导依赖Parkin和蛋白酶体的Miro蛋白的降解,导致线粒体释放驱动蛋白,进而抑制线粒体活性,这可能是线粒体自噬的起始步骤[13]。PINK1的缺乏可导致复合体I的缺陷及线粒体的裂解,降低细胞内Ca2+的处理能力,导致对应激损伤的敏感性增加。相关研究表明，PINK1蛋白具有神经保护作用,未突变的野生型PINK1可保护SH-SY5Y细胞免受应激诱导的线粒体功能障碍和凋亡性细胞死亡[14]。PINK1在体内外的消耗被证明会加剧α-突触核蛋白聚集诱导的毒性作用以及抑制蛋白酶体系统的降解。与之相反,在果蝇中恢复PINK1蛋白可以挽救α-突触核蛋白诱导的病理表型,但是PINK1减轻α-突触核蛋白毒性作用的机制仍不清楚[15]。最近的一项研究证明,PINK1还可以通过直接磷酸化自噬受体OPTN来促进线粒体自噬[16]。

1.3 PARKIN基因 PARKIN是第1个被发现的与常染色体隐性遗传性少年型PD相关的隐性基因,含有E3连接酶,可通过其介导的蛋白质泛素化对多种细胞代谢过程进行调节。其基因产物Parkin是必不可少的神经保护蛋白,在维持多巴胺能神经元的正常功能中发挥重要作用。在啮齿动物的大脑中，Parkin介导的GTP酶细胞分裂控制相关蛋白-1(CDCrel-1)的降解可诱导多巴胺神经元变性[17]。Parkin介导的非降解信号通过泛素化底物K63或K48连接的泛素链导致PD发生,其另一个底物为PARIS(锌指蛋白746),是过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1,PGC-1α)的最主要抑制因素。Parkin可通过泛素化作用调控PARIS的表达水平,间断性影响PGC-1α水平来调节线粒体生物合成[18]。研究表明,在α-突触核蛋白毒性、泛素-蛋白酶体系统功能障碍、Pael-R(Parkin的底物之一)的积累和Kainite(钾盐镁矾,一种含有重盐水合硫酸镁和氯化钾的白色矿物质)诱导的兴奋性毒性等不同的细胞损伤模型中,Parkin的催化活性作用皆被证实具有神经保护作用。在散发性PD病人中我们可以看到,由于氧化和硝酸化应激的损伤作用,经过翻译修饰后的Parkin失活,导致Parkin底物如氨酰基tRNA合成酶相互作用的多功能蛋白2(AIMP2)和远端上游元件结合蛋白1(FBP1)过度积累,进而导致多巴胺能神经元变性坏死[19 20]。

1.4 DJ-1基因 DJ-1是另一个与PD相关的基因,在大脑细胞质、线粒体和细胞核中作为同型二聚体广泛表达,其错意突变或缺失与常染色体隐性PD相关。DJ-1能够与活性氧反应,通过降低自身的等电点来降低ROS对细胞的损伤作用,亦可通过促进合成还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)发挥抗氧化作用。DJ-1基因可与复合物I相互作用,减少线粒体依赖性氧化应激的产生,通过维持线粒体的完整性来发挥细胞保护作用,其缺失可致线粒体出现膜电位降低、碎片增加和自噬标志物的积累等病态化表现。在经过半胱氨酸C106的氧化、赖氨酸K130的泛素化和半胱氨酸残基C46、C53以及C106的亚烷基化反应的翻译修饰后，DJ-1的保护作用才得以形成,尤其是C106残基的硝基化反应,可使NO基团转移到磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)上,降低磷酸酶活性,从而有助于神经元的存活[21]。此外,包括α-突触核蛋白聚集和控制、SOD1的激活、对转录调节因子P53、转录因子NF-E2相关因子2、蛋白质相关剪接因子(PSF)166的调节等在内的多种因素亦可对DJ-1的功能产生重要影响[22-23]。在氧化应激损伤反应过程中,DJ-1与PINK1/Parkin对线粒体起同等重要的保护作用,除通过抗氧化损伤的机制参与PD的病理过程外,最近的研究表明DJ-1可通过影响Parkin以及α-突触核蛋白参与PD的发病[24]。

1.5 LRRK2(PARK8)基因 LRRK2是含有一个催化中心的多结构域蛋白,由Ras复合物、GTPase蛋白质结构域、Roc结构域和激酶结构域组成。在已知的LRRK2突变体中，以激酶结构域中的G2019S突变体最多见。LRRK2基因的G2019S突变造成了5%～6%的常染色体遗传性PD以及近1%的没有已知家族史的散发性PD[25]。LRRK2 G2019S可通过解偶联蛋白水平来使线粒体的膜电位去极化,使其对MPP+损伤的敏感性增加,进而导致线粒体功能异常。LRRK2 G2019S亦可通过磷酸化DIP1加速线粒体的分裂,导致线粒体的片段化来损伤线粒体功能。Tau是一种微管相关蛋白,主要表达于中枢神经系统,可通过调节微管蛋白的装配和微管稳定性来调节轴突生长和轴突运输,因此Tau蛋白的正常功能对于神经元的可塑性和记忆巩固至关重要。LRRK2通过GSK-3β或Ste20激酶直接或间接磷酸化Tau蛋白,或直接使β-微管亚单位磷酸化影响微管的稳定,加速神经元的变性[26]。

2 环境因素与自噬和线粒体功能障碍

除上述提及的基因遗传因素外,PD的发生与环境因素密切相关。与之相关的环境因素主要包括1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)、6-OHDA以及除草剂、鱼藤酮、百草枯和含氯杀虫剂等。MPTP的毒性作用主要由其毒性代谢产物MPP+引起的。积聚在线粒体内的MPP+可通过抑制复合体I活性来干扰电子传递链,并导致ATP合成障碍和活性氧的产生。鱼藤酮和百草枯的结构模型与MPTP相似,并且研究表明这两种药物不仅可以损伤多巴胺能神经元,也可以通过抑制复合体I活性造成活性氧产生增多来诱导PD的发生。ROS的产生可损伤复合体Ⅰ和复合体Ⅲ,使线粒体和细胞质中的蛋白质发生氧化,导致线粒体功能障碍[27-28]。同时氧化应激损伤了UPS,可导致线粒体的损伤和错误折叠的蛋白质的累积[25]。线粒体呼吸链是6-OHDA的直接作用靶位,6-OHDA可通过抑制线粒体复合体I而产生氧自由基,使线粒体膜失去滤过控制，造成线粒体失能,从而诱导自噬过度活跃,CathepsinB表达增加,Bcl-2表达下降,促进线粒体膜电位下降,形成恶性循环,最终导致细胞死亡。有研究表明H2S与自噬也具有一定的相关性,硫化氢(H2S)可通过下调HIF-1α蛋白表达和转录活性介导神经细胞自噬抑制,但具体机制目前有待进一步探究。

3 总结与展望

自噬活性和线粒体稳态在PD的发病机制中扮演着重要角色,目前仍未发现有效的治疗方法来阻止PD病人多巴胺能神经元的进行性丢失。更好地理解自噬和线粒体功能障碍之间的分子相互作用,可为PD的预防和改善提供新的治疗方案。此外,在PD的发病机制中,特别是在识别多种神经退行性疾病发病机制的共同分子通路以及自噬和线粒体功能障碍之间的详细分子相互作用方面仍存在着巨大挑战,需进一步的研究以阐明其机制。